[发明专利]一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法

说明书

本发明涉及一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法，所述方法是通过将待测样品(全血、血清或血细胞)与底物腺苷进行反应，或者将待测样品(中药或化合物)与腺苷脱氨酶溶液及底物腺苷进行反应，然后通过液相色谱串联质谱法测定反应终止液中肌苷含量，再计算腺苷脱氨酶的活性。本发明的方法具有准确度、精密度、灵敏度高，稳定性好，操作简单，成本低，高通量的优点，为临床检测腺苷脱氨酶活性以诊断白血病、伤寒、系统性红斑狼疮、糖尿病、肝病、肿瘤等提供了一种更为有效的方法，也为筛选腺苷脱氨酶的抑制剂以治疗上述疾病提供了帮助。

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，具体地说，涉及一种液相色谱串联质谱法测定腺苷脱氨酶活性及筛选其抑制剂的方法。

背景技术

腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase；Adenosine aminohydrolase；ADA；EC3.5.4.4)是一种与机体细胞免疫活性具有重要关系的巯基酶，每分子至少含2个活性巯基。它也是嘌呤核苷酸代谢的关键酶，能特异性催化腺嘌呤核苷或脱氧腺嘌呤核苷脱氨生成次黄嘌呤核苷或次黄嘌呤脱氧核苷，而后经核苷磷酸化酶催化生成次黄嘌呤，最终氧化成尿酸排出体外。

ADA广泛分布于人体的多组织中，尤其在肠系膜、肝、脾、肾及淋巴细胞中水平较高，以盲肠、脾中含量最多，又以淋巴细胞活性最高，在纤维细胞、羊水细胞、肝、肾、肺、骨骼肌中也有发现。血液中ADA主要存在于红、白细胞(淋巴细胞、粒细胞)中，其含量为血清中的40～70倍，T淋巴细胞比B淋巴细胞该酶活性更高。血清中的ADA主要来源于肝脏，90％以上的ADA存在于肝细胞浆水溶性部分，其余位于核内，与核酸代谢有关。

正常水平的ADA对机体胞内和胞外的核苷代谢起了很重要的作用。ADA活性的改变常引起病理学上的改变。一方面，ADA的缺陷可导致免疫功能障碍^[1-2]。因遗传的常染色体隐性遗传性状而使ADA缺乏至产生严重的联合免疫缺陷(SCID)，它是一种表现为完全不存在细胞和体液免疫而反复性感染的严重疾病^[3]。ADA缺乏症占所有SCID病例的10-15％^[4]。另一方面，在许多疾病中也发现了ADA活性的升高，如白血病^[5]、伤寒^[6]、系统性红斑狼疮^[7]、糖尿病^[8]、肝病^[9]、肿瘤等。特别是在许多癌症患者中，ADA的活性显著升高，如直肠癌^[10]、乳腺癌^[11]、肾脏腺癌^[12]等。因此目前ADA活性检测被用作许多疾病的诊断指标，并且ADA活性抑制剂也被开发用于白血病、系统性红斑狼疮及肿瘤等多种疾病的治疗。

生物组织中直接测定ADA的含量非常困难，因为ADA含量微乎其微，每毫升血液中酶含量在皮克到纳克水平。因此临床测定ADA含量普遍是通过测定ADA所催化的反应速率来反映酶含量。腺苷常作为ADA酶促反应的底物，根据单位时间内腺苷的消耗量、产物肌苷或氨的生成量来评估ADA的活性。目前常用的方法包括：紫外分光光度法、比色法、化学发光法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、同位素分析法。

紫外分光光度法测定ADA含量的原理是：腺苷在265nm处有最大吸收峰，而肌苷在248nm处有最大吸收峰，通过测定ADA催化体系中265nm处吸光度的降低，即腺苷浓度的减少速率，或测定248nm处吸光度的升高，即肌苷浓度的生成速率，来实现ADA活性的测定。董佩杰等^[13]基于该方法测量ADA活性，搭建了简单快速的ADA抑制剂筛选平台。该方法操作简单，成本较低，但是存在很大的误差。一方面因为腺苷与肌苷的紫外吸收光谱有部分重叠，可能会存在干扰，另一方面其他有颜色的化合物或提取物会干扰吸光度的测定，容易造成假阳性或假阴性的结果。