[发明专利]一种长期保存过表达ANG-1的EPC的保存液

说明书

本发明属于生物医药领域，涉及一种细胞保存液，具体涉及一种长期保存过表达ANG‑1的EPC的保存液。所述保存液包括以下组分：白蛋白、维生素、肌苷、低分子右旋糖酐、氯化钠、氯化钾、乙醇、甘油、血管内皮生长因子、乙二胺四乙酸二钠、醋酸、醋酸钠、复方氨基酸和注射用水。该保存液无毒环保、成分明确、安全稳定，便于细胞保存和运输；本发明的长期保存过表达ANG‑1的EPC的保存液能提高细胞的保存时间和保存率，能维持细胞的高活力和生物学特性，具有廉价、高效、无毒的优势。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种长期保存过表达ANG-1的EPC的保存液。

背景技术

由于创伤、感染、肿瘤等原因造成的各种类型骨缺损是我们临床上遇到的常见问题。骨组织工程技术的逐渐兴起为骨缺损的修复提供了有效的解决策略。但在应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，导致修复失败，其主要原因就在于未能很好的解决组织工程骨的血管化问题，血管化问题现已成为制约组织工程骨应用于临床的“瓶颈”。血管生成素(Angiopoietin，ANG)是一种重要的与血管生成相关的因子，特别是血管生成素-1(Angiopoietin-1，ANG-1)特异性作用于内皮细胞Tie2受体，可召集血管周细胞和平滑肌细胞，通过内皮周围支持细胞的聚集，包装内皮管道，形成完整的血管壁，由单内皮细胞层向多细胞层过度，ANG-1能够完成血管的精细结构以及血管成熟，有效的防止炎症及VEGF所致的血管通透性增加，减少渗出水肿等副反应。血管内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)是一群具有游走特性，尚未表达成熟血管内皮细胞表型，能分化为血管内皮细胞直接参与血管形成。它在骨髓、脐带血及外周血中均存在，并能在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用，并以血管发生方式形成新生血管。然而由于EPCs的细胞数量有限，获取困难，体外培养时需要扩增，培养周期长，且需要经FN介导贴壁生长才有利于其存活，这些不足限制了其在动物实验及临床研究中的应用。将ANG-1基因作为目的基因转染EPCs，使其在EPCs内持续、高效的表达，优化EPCs促血管新生的效果，再将这种转染细胞种植于多孔生物活性玻璃内以构建血管化组织工程骨，最后再植入动物体内节段性骨缺损模型中，对该多孔复合活性材料的成骨、血管化机理，特别是血管化对材料成骨方面的影响进行深入研究，尤其期待其能够解决骨组织工程研究中的“瓶颈”--血管化问题。对于骨组织工程生物材料的设计，组织工程应用开发研究都有着重要的现实意义和广阔的应用前景。

虽然细胞治疗的临床应用前景已经得到了广泛认可，但是在实际应用仍有许多问题需要解决。细胞的生物活性直接影响了其治疗效果。因此，如何维持种子细胞的高活力成为了治疗关键。在此之前，人们用生理盐水或葡萄糖溶液作为种子细胞的保存液，生理盐水作为常用的输注介质，在临床应用上方便安全，但是细胞在生理盐水中活性的下降速度非常快，10小时之内细胞的活性丧失就达到30％之多，甚至会由于缺乏营养、溶液等张力或等渗力存在差异等原因，导致细胞在长期保存或运输中出现活力低下、大量溶胀死亡等现象。

目前，中国专利CN105028389B公开了一种红细胞保存液，该红细胞保存液的组成为腺嘌呤0.3-0.5g/L、葡萄糖25-35g/L、柠檬酸钠6-10g/L、肌苷0.2-0.4g/L、氯霉素0.2-0.3g/L、硫酸新霉素0.08-0.12g/L、氯化钠2.5-3.5g/L、磷酸二氢钠0.04-0.06g/L。中国专利CN106386785B公开了一种细胞保存液及其在流式样本保存中的应用，该细胞保存液其pH7.2-7.5，溶质由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂组成。中国专利CN104041484B公开了一种细胞保存液，它由氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、PEG10000、Proclin300、甲醇、醋酸-醋酸钠缓冲液组成。