[发明专利]蛋白质筛选和检测方法

说明书

本发明涉及一种从多肽文库对多肽进行鉴定和定量的方法。所述方法包括如下步骤：1、提供多肽文库和检测标记文库；2、生成嵌套文库，所述嵌套文库包含所述多肽和所述检测标记；3、对所述嵌套文库进行测序；4、在一个或多个独立于物理基因型‑表型连锁的筛选步骤中筛选所述嵌套文库的成员；5、从所筛选的多肽中分离所述检测标记；6、通过质谱分析对所述检测标记进行鉴定和定量；7、获得所筛选的多肽的序列。本发明还涉及多肽集合、检测标记集合以及质粒载体集合。

本发明涉及一种将检测标记附着于蛋白质文库和接下来使用所述标记对符合所限定的生物物理学或药理学标准的蛋白质进行鉴定和定量的方法。

描述。

背景技术

蛋白质筛选和蛋白质展示方法是现有技术对表现某些特征（例如，对于靶分子的高亲和力结合）的蛋白质进行鉴定或富集的方法。

在筛选中，逐一分析蛋白质。这是非常费力的，并且限于较低数量的试验。例如，在结合蛋白的筛选中，通过ELISA鉴定各结合蛋白候选物，进一步表征阳性ELISA命中，例如，通过尺寸排阻色谱、解折叠实验对其进行生物物理学表征，在动物模型中体内检测其治疗潜能。

在展示方法中，经数轮筛选富集整个蛋白质池（源于文库）。对于蛋白质池的处理允许无大量劳动情况下的巨大通量。然而，诸如噬菌体、核糖体或酵母菌展示的展示方法需要表型（蛋白质）和基因型（其编码核酸）之间的物理连锁。因为进行展示（即，噬菌体、核糖体以及编码DNA或RNA）所需的物理实体大小通常是实际结合分子（例如抗体片段）的超过100倍，这对于大多数分析来说是严重的限制。这不可避免地导致筛选偏差，并将可能的筛选压力限制到小亚组的可想象的筛选压力—当前仅不受展示颗粒巨大尺寸严重影响的筛选压力可应用（例如结合）。

基于上述现有技术，本发明的目的是提供在缺乏物理基因型-表型连锁的情况下从整个蛋白质文库鉴定符合所限定的生物物理学或药理学标准的各蛋白质的方式和方法。此目的通过本说明书的权利要求来实现。

术语和定义

本领域技术人员知道，在本说明书范围内，表示文库大小的数字涉及文库成员的多样性。大于文库II的文库I对应于包含比文库II更多数量的独特文库成员的文库I。具有100.000个成员的核酸文库可包含数百万个核酸分子，但是仅100.000个各自由所述文库中独特核酸序列表征的独特文库成员。相似地，具有1.000个成员的多肽文库可包含数百万个多肽分子，但是仅1.000种独特的多肽文库成员。表述“文库的一个成员”涉及可存在于多个相同拷贝的一个特别的文库成员。

在本说明书上下文中，表述“两个核酸序列符合读框”是指第一核酸序列的最后密码子和第二核酸序列的第一密码子之间的碱基对数量可被3除尽。

在本说明书上下文中，表述“多肽与检测标记缔合”、“多肽/检测标记与亲和标记缔合”分别表示前述两个成员均包含在一个一级氨基酸序列、即一个连续的多肽链中。具体地，所述检测标记和所述多肽可由一个或多个氨基酸分离。所述检测标记和所述亲和标记也可由一个或多个氨基酸分离。

在本说明书上下文中，表述“可切割元件”涉及易于被化学试剂或酶方式（例如蛋白酶）切割的肽序列。蛋白酶可为序列特异性性（例如凝血酶）或具有有限的序列特异性（例如胰蛋白酶）。可切割元件I和II还可包含在检测标记或多肽的氨基酸序列内，特别是当检测标记或多肽的最后氨基酸是K或R的情况。