[发明专利]可用于LC-MS分析的标记的聚糖氨基酸复合物及其制备方法

说明书

本文提供了方法，在所述方法中使糖基化蛋白质或肽经受肽键裂解以产生聚糖氨基酸复合物，其中连接了N‑连接的或O‑连接的聚糖。然后将衍生化试剂连接到所述氨基酸的N末端以提供标记的聚糖氨基酸复合物。随后经由包括HILIC SPE的一种或多种方法从基质分离所述标记的聚糖氨基酸复合物，并将其直接注入到LC或LC/MS系统上用于分析、检测和表征所述糖基化蛋白质或所述肽。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年10月3日提交的美国临时专利申请No.62/403,510的优先权，该申请以引用方式并入本文。

关于联邦政府资助研究或开发的声明

无。

联合研究协议缔约方名称

无。

背景技术

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(“MALDI-TOF-MS”)、电喷雾电离(“ESI”)以及联合利用电喷雾电离和低能量碰撞诱导解离(“CID”)的串联质谱(“MS-MS”)方法均可用于产生碎片离子以调查聚糖的序列和键，并且可在糖基化的表征中起着关键作用。

肽图分析为药物物质或产物选择性碎片化为离散肽的方法，这些离散肽可用于确认所需的产物结构。这些碎片的分离和鉴定以可重现的方式进行，使得深入分析可鉴定蛋白质一级结构中的细微(甚至同质异位)差异，诸如互补DNA的转录错误、点突变以及翻译后修饰(诸如糖基化、置换和截短)。由于肽图分析的复杂性和固有变异性，因此进行比较性程序，其中将测试样品的肽图与并列实验中制备的参照物质的肽图进行比较。

然而，O-连接的聚糖的电离和质谱检测可能是有问题的，这是由于聚糖部分的电离效率较差。例如，MALDI-TOF-MS相对较快地生成关于从天然重组糖蛋白和其他复杂生物样品释放的聚糖的性质和多样性的信息。中性聚糖在正离子模式下产生与钠阳离子化分子物质[M+Na]⁺相对应的强信号，并且通常伴随较弱的[M+K]⁺离子。然而，唾液酸化聚糖可能难以使用MALDI-TOF-MS分析，并且产生离子混合物，诸如[M+Na]⁺、[M+K]⁺、[M-nH+(n+1)Na]⁺和[M-nH+(n+1)K]⁺。Willy Morelle&Jean-Claude Michalski,Analysis of ProteinGlycosylation by Mass Spectrometry,Nature Protocols 2,1585-1602(2007)(WillyMorelle和Jean-Claude Michalski，通过质谱分析蛋白质糖基化，《自然-实验室指南》，第2卷，第1585-1602页，2007年)。此外，唾液酸化聚糖可在离子源中或在离子从离子源引出之后损失大量唾液酸，从而使聚糖特征谱显著失真。为了降低该损失，可用飞行时间(“TOF”)仪器在线性负离子模式下分析唾液酸化聚糖。然而，未在负离子模式下检测到中性聚糖。同上。

利用蛋白质分离方法和质谱分析的蛋白质组学研究近年来已经吸引相当大的关注。因此，需要用单独的质谱或结合其他检测技术来对O-连接的聚糖进行稳健检测，并且用包括但不限于聚糖特征谱分析实验(糖组学)和糖肽及糖脂分析中的多种来源进行这种检测。

发明内容