[发明专利]使用低压双重梯度再集中的色谱分析

说明书

提供了一种用于分离溶液中的分析物的系统。所述系统包括封闭用于结合溶液中的分析物的吸着剂的柱体或捕集柱；和导管，所述导管建立与具有保持环路的阀的流体连接，以实现在低压下通过所述柱体的洗脱。在进入环路之前，通过汇合的流动物流稀释或改性洗脱液。阀可以在从所述柱体上洗脱后切换到一个位置，用于在与色谱柱所需相当的高压下通过出排出端口排空保持环路。所述系统可以使用平行梯度形成/洗脱来交错分析，使得阻碍100％工作循环的基本上唯一的分析期是将第一分析物从阀移动并且到达检测器所需的时间。

发明领域

本发明一般涉及在样品的色谱分析之前的液相色谱和固相萃取领域，更具体地，涉及在这种分析过程中流动相梯度的形成和样品的处理。

发明背景

在分析化学品和生物分子时，将化合物的混合物分离成其各自的种类是极为常见的，以便简化随后的检测器响应。也就是说，对混合物的检测器测量通常产生无法解释的结果，而可以容易地解释对单独制成的成分的测量。用于将化合物混合物分离成更简单混合物的最广泛使用的技术之一是色谱分离。在色谱法中，基于每种化合物的一些物理化学性质的差异，在时间和空间上分离含有不同化学化合物的样品。作为一个简单的实例，可以举出“尺寸排阻色谱”，其中基于不同分子大小分离成分。这通过使含有样品混合物的液体(即流动相)通过含有色谱材料的导管(即固定相)来实现。在这种情况下，色谱材料典型地为多孔珠粒，其中大分子被流动相压在珠子周围的短路径上，而较小分子跟随流动相通过逐步变窄的孔隙，因此相对于大分子延迟。尺寸排阻色谱中的所需效果是最小化合物比大化合物更缓慢地穿过毛细管通路的长度，因此在毛细管通路的出口端递送，其时间延迟与其大小成反比。存在许多其他类型的色谱分离，每种都利用不同化合物之间的物理-化学性质的差异。液体可以通过压力或静电力或它们两者移动通过毛细管通路。

可以通过几种方法分析样品的级分，但是质谱法通常是与色谱法相关的非常频繁使用的方法，并且它始终不变地成为在通过液相色谱分离后用于分析生物分子例如蛋白质、肽和大多数代谢物的选择方法。

质谱仪和色谱系统都是部署和维护相对昂贵的仪器，因此它们必须尽可能多地产生每单位时间的数据；即，由于使用设备的成本，LC-MS是一个时间关键的过程。

通常，色谱分离仅在整个分析周期的小时间窗口内产生可用数据。相对于整个循环时间的数据产生时间称为“工作循环”。理想情况下，工作循环应接近100％，以便最有效地利用色谱设备和检测器。当分析生物分子，特别是生物分子的复杂混合物例如蛋白质组、代谢物组(metabolome)和脂质组(lipidome)时，质谱仪通常是高性能模型，其安装和维护非常昂贵。因此，例如蛋白质组学分析的高工作循环由于经济效益是特别理想的，但即使忽视价格/分析考虑因素，始终强烈期望在最短的时间期限内获得最大量的数据。

然而，比成本更重要的考虑因素通常是考虑LC-MS分析的分析灵敏度，因为许多分析必须对产生低信号响应的有限材料进行，如果不能获得必要的灵敏度，将导致分析完全失败。优化LC-MS灵敏度的最重要方法之一是缩小柱直径和流速的色谱参数，如本文所述。近二十年来，在MS分析之前，已经建立了称为“纳米-流动”LC的色谱变化形式用于分离蛋白质和肽。所述技术通常使用200nL/min至400nL/min的流速和75μm左右的柱直径。这提供了高分析灵敏度，然而，低流速也意味着纳米-流动LC-MS分析的循环时间很长，并且质谱仪没有记录数据的简单常规步骤占用了大量时间。这些步骤主要是将样品混合物加载到柱上，且随后用纯溶剂对加载的样品进行脱盐，而且流动相从混合点移动至色谱柱所需的时间(称作“停留时间”的时间)对整个分析时间做出极大贡献。