[发明专利]促转导素-C（Protransducine-C）：基因转移激活因子

说明书

具有序列(AA)的多肽。

本申请涉及一种多肽、一种N末端保护的多肽、一种含有所述多肽的药物，所述多肽用于基因治疗的用途、一种通过一种基因工程病毒构建体增强细胞感染的方法，所述多肽用于扩增转染或转导的用途。

近年来，由于应用方法的巨大进步，基因工程的重要性已经增加，因为不仅是蛋白质-肽类药物的生产，还有用稳定基因对细胞的转染作为实验室工具，最终将基因掺入细胞中以作为基因缺陷的替代物，这些方法可预见地对于许多疾病的治疗非常重要。

自第一个人类基因的克隆和重组生产以来，用于改变特定细胞功能的基因材料的掺入已成为生物医学基础和应用研究中不可或缺的工具。基因掺入方法的不断进步获得基因转移的优化。这些是长期历史中收集的经验，起初进展非常缓慢。

早在1953年由F.Crick和J.Watson阐明脱氧核糖核酸(DNA)功能之前，F.Griffith在20世纪20年代末成功地在实验中将非致病性肺炎球菌菌株转化为病原体。这种转变的发生是一种幸运的情况，因为肺炎球菌具有罕见的DNA摄取自然能力。J.Lederberg，M.Delbrück和S.Luria等人使用噬菌体成功地将选择的DNA掺入原核生物，即所谓的转导。随着细胞培养的建立，即在体外条件下培养真核细胞，开发了许多用于转染的物理和化学方法。物理方法更常用，但需要昂贵的设备，包括电穿孔和显微注射；化学方法的使用更加简单，例如自20世纪80年代以来一直在使用的磷酸钙沉淀法，或在20世纪90年代早期广泛使用的基于阳离子脂质或阳离子聚合物的方法。然而，这些方法的使用总是取决于细胞或DNA。而且，掺入细胞中的DNA通常是染色体外的(瞬时转染)，因此不会传递给子细胞。然而，已知噬菌体(例如λ噬菌体)也能够将它们的DNA整合到宿主基因组中(前噬菌体，溶原性感染途径)。从这里开始，仅仅是(1981/1982)“逆转录病毒作为基因载体的建立”(由Doehmer等人和Tabin等人提出)的一小步。病毒是物种特异性的和器官/组织特异性的，这就是为什么并非所有病毒都感染所有(真核)细胞的原因。病毒包膜的改变(糖蛋白的替代，所谓的假型病毒)以及肽(多数为阳离子)的添加旨在提高转导效率。

病毒颗粒摄取的第一个增强剂在HIV研究中引起了关注。在通过特定细胞试验分析体外感染期间，观察到血液过滤的肽对HIV融合的抑制(Münch等人，VIRIP)。

已经表明，令人惊讶地天然存在的这些蛋白质片段在人类精子中形成纤维结构，作为增强子或“病毒感染的精液衍生增强剂”(SEVI)，其特征为淀粉样蛋白原纤维。这种纳米纤维增强了病毒与其靶细胞的附着，并使病毒感染的速率提高了几十倍。

这被用于改进用于基础研究和可能的未来治疗应用的逆转录病毒基因转移。因此，可见用于基因治疗的慢病毒和γ-逆转录病毒载体在不同细胞类型(例如人T细胞、宫颈癌细胞、白血病细胞、造血干细胞和胚胎干细胞)中存在SEVI蛋白时表现出多倍增加的基因转移率(Wurm等，J Gene Med.2010,12,137-46；Wurm等，Biol Chem.2011,392,887-95)。

对SEVI和seminogeline等进一步增强子的开发的研究引发了这样的假设：来自病毒包膜蛋白的肽也可以适合作为转染的增强子，这令人惊讶地具有出乎意料的高成功率(Maral Yolamanova等，Nature Nanotechnology，第8卷，第2期，第130-136页)。因此，例如，可以显示用不同浓度(1-100μg/ml)的促转导素-A(protransducine-A)(同义词：EF-C)预孵育的HIV病毒在报告细胞中表现出感染率，比正常情况下其在报告细胞中高几十倍。假设的作用机制是，EF-C形成纤维状结构，其能够结合、浓缩病毒并因此增加病毒对细胞的进入。除了感染病毒颗粒外，EF-C还可以高效率地增强慢病毒和逆转录病毒颗粒转导到多种人类细胞类型(T细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、造血干细胞)中，这些被应用到基因治疗中(Maral Yolamanova等，Nature Nanotechnology，第8卷，第2期，第130-136页)。EP2452947A1也涉及促转导素-A。