[发明专利]杂合神经毒素

说明书

本发明涉及包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，并涉及它们在治疗中的用途。

发明领域

本发明涉及具有提高的治疗特性的杂合神经毒素，特别是对于神经节苷脂具有更高的选择性结合亲和性。

背景

梭菌属(Clostridia)中的细菌产生了高强度和特异性的蛋白质毒素，其可以毒害它们所递送至的神经元和其他细胞。这样的梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的那些毒素。

梭菌神经毒素中一些最强烈的毒素是已知的。例如，根据血清型，肉毒杆菌神经毒素对于小鼠具有范围为0.5至5ng/kg的中位值致死剂量(LD₅₀)。破伤风毒素和肉毒杆菌毒素通过抑制受影响的神经元的功能(尤其是神经递质的释放)来起作用。肉毒杆菌毒素在神经肌肉接头处起作用并抑制外周神经系统中的胆碱能神经传导，而破伤风毒素在中枢神经系统中起作用。

实际上，梭菌神经毒素作为单链多肽合成，其通过蛋白水解切割事件进行翻译后修饰，以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，常常称为激活位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链(dichain)形式是毒素的活性形式。两条链称为重链(H-链)(其具有大约100kDa的分子量)和轻链(L-链)(其具有大约50kDa的分子量)。H链包含N-末端易位组分(H_N结构域)和C-末端靶向组分(H_C结构域)。切割位点位于L-链和易位结构域成分之间。Hc结构域结合其靶神经元并且结合的毒素经由内体内在化至细胞中后，H_N结构域将L-链穿过内体膜易位并进入细胞溶质中，并且L-链提供了蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。

非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白(例如，SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白(syntaxin))的胞内转运蛋白来起作用－参见Gerald K(2002)“Cell andMolecular Biology”(第4版)John Wiley&Sons，Inc。首字母缩写SNARE源自术语可溶性NSF附着受体(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF表示N-乙基马来酰亚胺-敏感因子。SNARE蛋白是胞内囊泡融合不可或缺的，并且因此是分子通过囊泡转运从细胞分泌不可或缺的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且呈现出对于SNARE蛋白的高底物特异性。因此，一旦递送至目标靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制从靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒性的L-链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G的L-链蛋白酶切割VAMP，BoNT/A和BoNT/E的L-链蛋白酶切割SNAP25以及BoNT/C的L-链蛋白酶切割SNAP25和突触融合蛋白，这导致神经递质释放的抑制和随后的神经性麻痹(Rossetto,O.等，“Botulinum neurotoxins:genetic,structural and mechanisticinsights.”Nature Reviews Microbiology 12.8(2014):535-549)。

鉴于SNARE蛋白普遍存在的性质，梭菌神经毒素，如肉毒杆菌毒素，已经成功地用于各种治疗中。目前全部批准的包含BoNT的药物/化妆品制剂含有天然存在的从梭菌菌株纯化的神经毒素(在或的情况中是BoNT/A，以及在的情况中是BoNT/B)。