[发明专利]突变型AlkB基因

说明书

提供了表达突变型AlkB酶的微生物细胞，所述突变型AlkB酶在AlkB的野生型序列中包含至少一个点突变，其中所述点突变在野生型AlkB酶的氨基酸位置V129和/或T136处。还提供了通过使用该细胞产生ω‑羟基羧酸和/或其酯的方法。

发明领域

本发明涉及由至少一种C₆-C₁₄羧酸产生至少一种ω-羟基羧酸和/或其酯的生物技术手段。特别地，生物技术手段可以使用包含至少一个特异性点突变的突变型AlkB基因，所述突变能够特异性地产生ω-羟基羧酸和/或其酯。

发明背景

ω-羟基化(ω-羟基)羧酸衍生物作为工业试剂的组分具有许多商业用途。可用于工业领域中的ω-羟基羧酸衍生物的一些实例包括ω-羟基羧酸；ω-羟基羧酸甲酯；ω-氧代羧酸；ω-氨基羧酸；ω-氨基羧酸甲酯；α-,ω-二酸(α,ω-二酸)；ω-羧基羧酸甲酯(ω-羧基羧酸甲酯)；α-,ω-二酯(α,ω-二酯)；α-,ω-二醇(α,ω-二醇)；等。这些化合物也可用作产生其它各种化合物的前体。例如，这些前体可用于产生α,ω-二羧酸，且α,ω-双官能分子是聚合物树脂、金属工作液、粘合剂、腐蚀抑制剂、电容器电解质、二酯合成润滑剂、纤维、粉末涂覆固化剂、增塑剂、聚酯涂料、环氧树脂、聚酰胺树脂、香料、芳香剂、表面活性剂、去垢剂、添加剂等的工业应用中特别重要的化学品。

通常，ω-羟基羧酸衍生物主要由石油基材料或由石蜡和羧酸至ω-羟基羧酸和/或其衍生物的生物转化来产生。用于产生这些化合物的化学方法需要使用危险试剂。本领域中使用的方法也是能量密集的并且对环境造成很大的损害。替代性产生的发酵途径，尽管被认为是绿色工艺，但仍然过于昂贵，并且在可制备的产品的类型和数量方面受到限制。

因此，本领域需要改进的产生ω-羟基羧酸及其衍生物的绿色方法。

在产生ω-氨基月桂酸甲酯的一个实例中，前体可以是月桂酸甲酯(LAME)，其中中间体可以是ω-羟基月桂酸甲酯(HLAME)。单加氧酶AlkB是已知催化由LAME形成HLAME的反应的酶。AlkB酶还能够催化HLAME氧化为ω-氧代月桂酸甲酯(OLAME)。因此，单加氧酶AlkB能够催化两个氧化步骤，这导致由LAME经由HLAME形成OLAME。然而，AlkB酶还能够催化OLAME转化为十二烷二酸单甲酯(DDAME)，这导致OLAME的产物产率降低。

因此，本领域需要改进的生物技术方法，其增加来自用作底物的相应的羧酸和/或其酯的特定ω-羟基化羧酸和/或其酯的产率，同时减少不必要副产物的产生。本领域还需要有效地增加所需产物诸如HLAME和/或OLAME的产率。

发明描述

本发明试图通过提供相对于野生型酶包含至少一个点突变的突变型AlkB酶来解决上述问题。突变型酶可以在至少一个细胞中转录以产生表达突变型AlkB酶的微生物细胞。表达突变型AlkB酶的该细胞能够由用作底物的相应羧酸和/或其酯产生至少一种ω-羟基化羧酸和/或其酯。特别地，羧酸和/或其酯可选自C₆-C₁₄羧酸和/或其酯。特别地，相对于表达野生型AlkB酶的细胞，表达突变型AlkB酶的该细胞能够产生更多的ω-羟基化羧酸和/或其酯。来自表达突变型AlkB酶的细胞的ω-羟基化羧酸和/或其酯的产率相对于表达野生型AlkB酶的细胞更高。在一个实例中，突变型AlkB能够在其中突变型AlkB相对于野生型细胞表达(即，其中不表达突变型AlkB酶)的细胞中增加ω-羟基月桂酸甲酯(HLAME)的产生和/或积累。

根据本发明的一个方面，提供了至少一种表达突变型AlkB酶的微生物细胞，所述突变型AlkB酶在AlkB的野生型序列中包含至少一个点突变，其中所述点突变在野生型AlkB酶的氨基酸位置V129和/或T136处。特别地，突变型AlkB酶中的点突变在野生型AlkB酶的氨基酸位置V129和/或T136处。