[发明专利]病毒载体编码异构水解醇的相对效力测定

说明书

提供了用于测定异构水解酶蛋白的功能和/或活性和/或效力的方法。

相关申请

本申请要求于2016年4月28日提交的美国临时专利申请No.62/328,916的优先权。前述申请的包括所有文本、表格、序列表和附图在内的全部内容通过引用并入本文。

引言

异构水解酶(isomerohydrolase)活性或效力可以通过定量由这些酶产生的反应产物来测量。本发明涉及测量异构水解酶活性和/或效力。

发明内容

本发明提供了用于测量和/或检测异构水解酶(isomerohydrolase)活性的方法。在某些实施方案中，方法包括使用非放射性异构水解酶底物或异构水解酶底物的前体，并检测通过异构水解酶转化产生的非放射性反应产物。在某些实施方案中，方法包括使用质谱法定量反应产物，从而测量和/或检测异构水解酶活性。

在特定的实施方案中，一种测量和/或检测异构水解酶活性的方法，其包括：(a)在允许细胞转导的条件下，使表达卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)的细胞(例如，真核细胞)与包含编码异构水解酶蛋白(例如，RPE65)的转基因的病毒载体(例如，腺相关病毒(AAV)载体)接触；在允许表达所编码的所述异构水解酶蛋白(例如，RPE65)的条件下孵育病毒载体转导的细胞；裂解转导的所述细胞以产生包含所编码的所述异构水解酶蛋白的提取物(例如细胞提取物)；将所述提取物(例如细胞提取物)与底物一起孵育一段时间，并在允许底物被异构水解酶蛋白转化为反应产物的条件下进行；将所述反应产物进行柱(液体)色谱法处理，从而产生柱(液体)色谱法纯化的反应产物；以及对所述柱(液体)色谱法纯化的反应产物进行质谱法处理，从而定量所述反应产物，其中所述反应产物的量反映异构水解酶活性，从而测量异构水解酶活性。

在多种实施方案中，所述异构水解酶蛋白包含视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。在多种实施方案中，所述异构水解酶蛋白包含野生型视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。在多种实施方案中，所述异构水解酶蛋白包含变体或突变体视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。在多种实施方案中，所述异构水解酶蛋白包含哺乳动物视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。在多种实施方案中，所述异构水解酶蛋白包含人视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。

在多种实施方案中，所转导的所述细胞包含哺乳动物细胞。在多种实施方案中，所转导的所述细胞包含人细胞。在多种实施方案中，所转导的所述细胞包含人胚肾(HEK)293细胞。

在多种实施方案中，所转导的所述细胞稳定或瞬时表达LRAT。在多种实施方案中，所转导的所述细胞稳定或瞬时表达CRALBP。在多种实施方案中，所转导的所述细胞稳定或瞬时表达LRAT和/或CRALBP。

在多种实施方案中，所述底物包含全反式视黄基酯。

在多种实施方案中，步骤(d)包括将所述底物的前体加入到所述提取物中，其中所述前体通过所表达的所述LRAT转化为所述底物。在多种实施方案中，步骤(d)包括向所述提取物中添加细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)和所述底物的前体，其中所述前体通过所表达的所述LRAT转化为所述底物。

在多种实施方案中，所添加的CRALBP的量介于约50和约500μg之间。

在多种实施方案中，所述前体包含全反式视黄醇或由其组成。在多种实施方案中，添加所述前体(例如所述全反式视黄醇)使得最终浓度为约1至约20mM。

在多种实施方案中，所述反应产物包含11-顺式-视黄醇或由其组成。

在多种实施方案中，步骤(d)、(e)和/或(f)在暗处、在昏暗光下或在暗黄色光下进行。

在多种实施方案中，所述底物、前体或反应产物是非放射性的。