[发明专利]用于适配子对选择的方法

说明书

已经开发了用于在自由溶液中选择针对靶点分子的单个或多个适配子对的方法。这些方法利用新的协同进化途径来选择针对一个或多个靶点的适配子对，其中在靶点结合时一个或多个适配子的配对触发适配子可扩增性。以这种方式，通过一轮或多轮选择过程的适配子配体的富集主要基于自由溶液中适配子的靶点驱动的紧密接近。使用阳性或阴性选择方法将靶点结合和富集偶联。这些技术通常应适用于许多不同类型的靶点分子，为分析、制备和治疗目的提供抗体、药物或其他结合分子的替代物。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年6月17日提交的美国临时申请序列号62/351,890的优先权的权益，其内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于从随机化寡核苷酸文库开始获得对于目标靶点有选择性的成对寡核苷酸适配子的方法、试剂和试剂盒。

背景技术

适配子是小的人工配体，包括能够以高亲和力结合特定目标靶点部分的单链DNA、RNA或多肽分子。约二十五年来，适配子一直被认为是抗体的潜在替代物，用于作为诊断和/或治疗目的使用。适配子通常由通过基于亲和力的针对目标靶点的分配筛选候选寡核苷酸的随机文库而获得。适配子在宽的pH和温度范围内具有高的结构稳定性，使其成为用于广谱的体外、离体和体内应用的理想试剂。

在1990年，Tuerk等,1990(Science 249,505-510)和Ellington 1990(Nature346,818-822,doi:10.1038/346818a0)开发了模拟进化过程的体外方法。该过程被称为指数富集的配体系统进化(SELEX)。SELEX过程利用进化的基本概念，运用变异、选择和复制以从核酸分子(即寡核苷酸)的起始库获得高靶点亲和力和特异性。通常，为了选择核酸(寡核苷酸DNA或RNA)适配子，通过合成在从约20至约100个核苷酸的大小范围内的短寡核苷酸文库(约10¹⁴个不同序列)来实现变异。每个寡核苷酸包括侧翼为引物区域的内部随机区域，用于随后通过合适的扩增反应扩增，例如用于DNA的聚合酶链式反应(PCR)，或用于RNA的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。由于文库中大数量的独特序列，至少一些适配子分子以特异性和亲和力结合靶点的可能性很高。接下来，通过将核酸库与固定在珠上的靶点分子一起温育，然后洗去非结合序列来实现选择。结合的适配子分子被洗脱并且扩增，形成用于下一轮SELEX的输入。通过使用PCR或一些其他扩增方法扩增结合的寡核苷酸来实现复制。然后将从一轮SELEX获得的寡核苷酸库(即选择后扩增)用作用于下一轮SELEX的输入，直到一组寡核苷酸(即核酸适配子)被富集，其紧密并且特异性地结合至靶点分子。最近在随机文库的制备以及在基于亲和力的分配中的技术进步使得适配子具有与抗体等同的亲和力。

该技术已应用于针对无机组分、小有机分子(Ellington,等,1990,Nature346,818-822,doi:10.1038/346818a0)、核苷酸(Sassanfar 1993,Nature 5；364(6437):550-3)、辅因子(Lorsch 1994,Biochemistry,33(4):973-82)、核酸(Boiziau,等,1999,J BiolChem.30；274(18):12730-7)、氨基酸(Majerfeld等,2005J Mol Evol.61(2):226-35)、碳水化合物(Jeong等,2001,Biochem Biophys Res Commun.16；281(1):237-43)、抗生素(Wang1996,Biochemistry,35(38):12338-46.)、肽(Ylera等,2002,.Biochem Biophys ResCommun290(5):1583-8)、蛋白质(Tuerk,1990同上)以及甚至结构复杂，诸如细胞(Shangguan等,2006Proc Natl Acad Sci USA.103(32):11838-43)来选择DNA或RNA适配子。

适配子优于抗体的优点有容易体外合成、修饰灵活、靶点范围广泛、可重复使用性和热/化学稳定性高。非免疫原性和解毒剂的可用性增加了适配子作为治疗药物的价值。