[发明专利]可用于纳米孔系统的位点特异性生物缀合方法和组合物

说明书

本公开涉及提供蛋白(诸如孔形成蛋白α‑溶血素)与生物分子(诸如DNA聚合酶)的快速、有效的位点选择性缀合的方法和相关组合物，以及此类位点选择性蛋白‑生物分子缀合物在纳米孔装置和方法中的用途。

技术领域

本公开涉及用于将蛋白(诸如孔形成蛋白、α-溶血素)与生物分子(诸如抗体、受体和酶，诸如DNA聚合酶)缀合的快速、有效的化学反应。

背景

已经开发了使用纳米孔的单分子边合成边测序(SBS)技术。参见例如，美国专利公开号2013/0244340 A1和2013/0264207 A1。纳米孔SBS涉及使用聚合酶来合成与靶序列模板互补的DNA链，且随着每个核苷酸单体添加至正在生长的链而确定其身份，由此确定所述靶序列。经由位于聚合酶活性位点和正在生长的链附近的纳米孔，检测每个添加的核苷酸单体。获得准确的信号要求将聚合酶活性位点适当定位在纳米孔附近。通常通过将聚合酶共价连接至构成纳米孔的孔-蛋白来实现适当的定位。

单体孔形成蛋白具有范围少至5 kDa至80 kDa的分子量，且这些单体形成6、7、8、9、10或更多个单体的大多聚复合物，其具有160 kDa、180 kDa、200 kDa、220 kDa或更多的分子量。在合适的条件下，这些多聚复合物通过脂质双层膜自发地形成孔。来自金黄色葡萄球菌的充分研究的孔形成蛋白α-溶血素(α-HL)具有33 kDa的单体分子量且自发地形成具有231 kDa的分子量的七聚孔复合物。聚合酶是分子量范围为约60 kDa至100 kDa的大蛋白，并且在一些情况下是甚至大得多的多聚复合物(例如，RNA聚合酶~400 kDa多聚体)。DNA聚合酶I的Klenow片段具有68 kDa的分子量。

因此，为了提供纳米孔传感器将这些孔形成蛋白(如α-溶血素七聚体)与大生物分子(如DNA聚合酶)缀合的任何反应的动力学都将受到用此类大型大分子可实现(且可用相对低的量)的低浓度的极大限制。此类大蛋白在水溶液中的最大溶解度通常限于近似0.1至10 mg/mL。因此，用于缀合反应的溶液中的两种大分子的浓度限于~1 µM至1000 µM。例如，α-溶血素蛋白孔由7个相同的亚基组成，总共约235,000分子量。因此，10 mg/ml的溶液具有约42 µM的浓度。这种相对低的浓度范围有效地将活性缀合化学限制至具有极快、不可逆反应速率的那些。

WO2015/148402A1描述了可用于纳米孔测序的标记的核苷酸，且描述了用于将α-溶血素附接至聚合酶的两种方法。一种方法涉及使用SpyTag-SpyCatcher酶促缀合反应(参见例如，Zakeri和Howarth (2010).JACS 132:4526-7)。在该方法中，SpyTag肽片段与α-HL单体的C端附接作为重组融合物，并且SpyCatcher蛋白片段与Phi29 DNA聚合酶的N端附接作为重组融合物。第二种方法涉及在用反式环辛烯基团修饰的α-HL和用6-甲基-四嗪基团修饰的聚合酶之间使用反电子需求的Diels-Alder (IEDDA)反应。

天然化学连接(NCL)最初被开发为合成方法，其允许通过连接多肽片段延伸合成多肽，同时维持天然肽键合结构。(参见例如，Dawson等人, “Synthesis of proteins bynative chemical ligation,” Science 1994, 266, 776–779)。NCL的化学计量效率和位点特异性使其可用于糖肽合成和其中保留天然肽键重要的其他合成方法。(参见例如，Shin等人, “Fmoc-Based Synthesis of Peptide-α-Thioesters: Application to the TotalChemical Synthesis of a Glycoprotein by Native Chemical Ligation,” J. Am.Chem. Soc. 1999, 121, 11684–11689.)