[发明专利]pH响应性荧光化合物和应用其的线粒体自噬检测用组合物及细胞内线粒体自噬的检测方法

说明书

本发明公开一种在细胞内线粒体上发生特异性局部化，在溶酶体中的弱酸性pH环境下呈现出强荧光发射，且不容易受到来自自体荧光(self‑fluorescence)和细胞内的其他荧光物质的背景荧光的干扰的新的pH响应性荧光化合物及应用该化合物的线粒体自噬检测用组合物以及细胞内线粒体自噬的检测方法。该pH响应性荧光化合物如下述通式所示，在通式中，L表示接头，X表示药学上允许的阴离子，Y表示可与线粒体蛋白质上的官能团共价结合的反应性官能团。

技术领域

本发明涉及新的pH响应性荧光化合物和应用该化合物的线粒体自噬检测用组合物以及细胞内线粒体自噬的检测方法。

背景技术

在细胞中，存在对于细胞内废弃的蛋白质、细胞器(organelle)等进行再利用或代谢的分解过程，该过程被称为自噬(autophagy：自食)。在该过程中，废弃物质被由脂质双层膜构成的被称为自噬体(autophagosome)的隔离膜所覆盖，并经过与溶酶体(lysosome)融合而被分解。通过自噬进行线粒体(mitochondrion)选择性分解去除的机制，被称为线粒体自噬(mytophagy)，起到使生物体对于与线粒体功能障碍相关的疾病产生防御的作用。

作为检测线粒体自噬的通常方法，可以列举如下方法：溶解细胞，从得到的mRNA通过蛋白质免疫印迹法(Western Blot)确认线粒体自噬相关因子的表达。由于该方法会破碎细胞，不能进行活细胞成像(live cell imaging)。

作为细胞内成像的代表性的方法，有如下方法：在线粒体中使被称为Keima的pH响应性荧光蛋白质得以表达，并监控来自Keima的荧光强度的方法(例如，参照非专利文献1)。Keima的激发光谱(excitation spectrum)随着pH发生变化。在中性环境下短波长侧(440nm)呈优势，在酸性环境下长波长侧(550nm)呈优势。对来自这两个激发波长的图像数据所得到的比值(Ratio)(550nm/440nm)图像进行观察，可知在中性环境下Keima的比值变低，在酸性环境下Keima的比值变高。通过利用该现象，能够从荧光图像读取伴有线粒体自噬的线粒体的pH变化，检测出线粒体自噬。但是，由于该方法需要在细胞内进行Keima的表达，因此并不是可适用于所有细胞。

据此，作为能够穿透细胞膜而被导入细胞内，在线粒体上发生特异性局部化(localization)，并且发光强度会响应线粒体的pH变化而发生变化的pH响应性荧光色素，有人提出了下述化学式所示的化合物(参照非专利文献2)。该化合物在分子内包括：在线粒体上发生特异性局部化的三苯基膦基(triphenyl phosphonium groups)、具有pH传感器功能的哌嗪(piperazine)环、可与线粒体蛋白质共价结合的反应性官能团的氯甲基(chloromethyl group)、作为荧光生色团的萘酰亚胺(naphthalene imide)。

[化学式1]

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:

Kogure,T.,Karasawa,S.,Araki,T.,Saito,K.,Kinjo,M.,and Miyawaki,A.,Afluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitatesdual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy；NatureBiotechnology.24:577-581(2006).

非专利文献2: