[实用新型]一种猪流行性腹泻病毒快速早期诊断试纸

说明书

技术领域

本实用新型涉及检测试纸，特别是一种适用于针对猪流行性腹泻病毒感染的早期诊断试纸。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状的肠道传染病。2010年以来，该病在我国多个省份暴发流行，给生猪产业造成了巨大的经济损失。当前，该病已成为制约我国养猪业健康发展的重要猪病之一。

快速准确的疫病诊断是防治猪流行性腹泻的重要前提，特别是随着病毒在猪群当中的逐步适应，PED在许多猪场出现了新的流行特点，如死亡率较以前有所降低、发病日龄延后以及临床症状越来越不典型等，从临床表现上很难与其它病原引起的腹泻病进行鉴别。病毒分离与鉴定是诊断PEDV感染最为直观的方法，然而，分离PEDV需要特定的条件而且较为费时，不能对其进行快速诊断。血清学诊断方法中，如中和试验、荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验等，由于其较高的非特异性以及需要特定的仪器，限制了其在临床的应用范围，特别是在基层的应用。另外，随着分子生学技术的发展，尽管许多实验室建立了用于诊断PEDV的RT-PCR和荧光定量PCR方法，但由于以上方法需要特殊的仪器设备以及专业的人员操作，目前只适用于实验室诊断。因此，目前需要建立一种检测准确快捷、操作方便、更易于基层现场诊断的PEDV诊断方法。

发明内容

本实用新型的目的是提供一种可以快速检测猪流行性腹泻病毒的快速早期诊断试纸。

本实用新型的技术方案是，一种猪流行性腹泻病毒快速早期诊断试纸，它包括支撑层，保护膜，其特征在于：在支撑层上方依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素层和吸水垫；采用经过Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析纯化后的重组N蛋白标记胶体金作为检测探针设于结合垫上；分别用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）和His单抗包被硝酸纤维素膜作为检测线和质控线，共同完成试纸的组装。所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；所述吸水垫用吸水纸制成。所述样品垫由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。所述结合垫（金标蛋白纤维层）由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜制成。在所述样品垫、结合垫及吸水垫上敷设有保护膜。该试纸的结构包括手柄端（吸水垫一端）、测试区（由质控线、检测线组成）、样品端（由结合垫和样品垫组成）三部分，组装过程为：先将NC膜黏贴固定于支撑板中间，分别在NC膜的上端粘上吸水垫，下端粘上结合垫（胶金垫），然后在结合垫的一端再粘上样品垫，各层之间重叠约1-2 mm。组装好的试纸半成品通过切割（切割宽度为 4.08 mm）后装入试纸塑料卡壳中，压紧后完成装配，室温条件下干燥保存。

所述胶体金标记的重组N蛋白是通过以下方法制备的：

以柠檬酸钠还原法制备金溶胶：在50-100 mL沸腾的0.01-0.05wt% 氯金酸水溶液中加入2-4 mL的0.5-2 wt % 柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15-20nm的胶体金溶胶；以0.1 mol/L的K₂CO₃ 调节胶体金溶胶的pH值至8.5-9.5。按每毫升胶体金溶液标记115.2 µg的重组N蛋白，10 min后，加20 wt % 的PEG-10000至PEG -10000的终浓度为0.05%，4 ℃下、1500-3000 r/min离心20 min，除去未结合的胶体金颗粒，4 ℃下、15000 r/min离心1 h，弃上清液，获得初步纯化的金标蛋白混合物。

所述试纸诊断原理及流程如下：

用生理盐水稀释后的待检样品滴于样品垫，由于毛细作用，样品将从样品垫一端向吸水垫一端层析扩散，如果待检样品中含有PEDV IgG，包被在结合垫上的金标N蛋白将会与之结合，当扩散至NC膜上的检测线（T线）位置时，IgG的Fc片段与SPA结合，在此处由于金标N蛋白-IgG-SPA复合物的聚集而形成一条红线；当扩散至质控线（C线）位置时，C线上的抗His单抗IgG则会与金标N蛋白结合，形成另一条红线，此时结果可判为阳性。当待测样品中不含PEDV IgG抗体时，金标抗原不能与之结合形成抗原-抗体-胶体金复合物，检测线上的SPA也就不能拦截金标抗原，此时检测线处无红色条带，结果判为阴性。而无论样品为阳性还是阴性，质控线上的His单抗IgG始终能与金标抗原中的N蛋白反应而显示一条红线，若不显示则表示试纸失效，因此能够通过质控线判断该试纸的可靠性。