[发明专利]与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用。本发明是通过将人抗体IgG恒定区CH2结构域中与FcRn存在相互作用的螺旋区附近氨基酸进行突变后获得。相对于野生型的CH2结构域，本发明突变体具备较好的稳定性和抗聚集能力，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本；与FcRn的pH依赖性结合得到了增强，为以其为骨架发现新型单域抗体药物奠定了良好的基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用。

背景技术

单克隆抗体以其特异性强、灵敏度高，广泛应用于各个领域，尤其是生命科学研究和临床治疗方面，如ELISA、Western blot、免疫荧光分析、疾病快速诊断以及作为生物制剂治疗各种疾病。进入21世纪以来，人们也开始越来越关注治疗性单克隆抗体药物的研发与临床应用，主要因为它具有如下优势：对人体毒副作用小；具备天然的效应功能同时对靶标高度的特异。因此，越来越多的单克隆抗体被批准用于临床。

随着抗体研究的不断深入，人们发现全长抗体的分子量较大(～150kD)，使它们的组织渗透性较差，也难以结合一些空间上有位阻效应的关键表位，从而影响活性。解决的策略之一是将全长抗体进行小型化，由此开发了一系列具有结合功能的抗体片段：如Fab(50-60kD)、单链抗体(scFv，20-30kD)、重链可变区抗体(VH，12-15kD)(单域抗体)等小型化抗体。这些抗体片段相对于全长单抗，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力，有些甚至能够口服用药。

抗体Fc片段的CH2结构域也是小型化抗体的一个重要改造方向。由于其是Fc片段的一部分，因此包含有与FcRn结合的部分位点。目前已知，与FcRn的pH依赖性结合是IgG具有较长血浆半衰期的一个重要因素。

CH2的稳定性较弱，需要进行优化。通过引入一对二硫键得到一个CH2的突变体m01，相对CH2，其Tm值提高近20℃(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2009)；通过截去CH2的N-端的七个处于无规则状态的氨基酸，得到一个截短的突变体CH2s，相对CH2，CH2s的抗聚集能力得到显著提高(Gong R,et al.,Mol Pharm.,2013)。将这两者结合之后得到一个新的突变体m01s(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2011)(图1)，它的Tm值比CH2的Tm值高30℃，具有更好的可溶表达与蛋白酶抗性。更为重要的是，相对于CH2，m01s具有更好的依赖于pH的与人FcRn的结合能力，在不同动物模型中的血浆半衰期可达10小时左右，远远长于与其分子量相似的其它结构域(如VH的血浆半衰期仅有几分钟)(Gehlsen K,et al.,MAbs,2012)。因此，m01s可以作为一个理想的骨架用于抗体库的构建和筛选。

新生的Fc受体——母源IgG向乳中分泌和被新生动物摄取均需要通过胞转作用穿越上皮细胞屏障,这个过程需要一种具有转运功能的受体即新生儿Fc受体(FcRn)的参与。在生理pH为7.4时,FcRn不与IgG结合,但是在内涵体酸性pH6～6.5的条件下，FcRn与IgG Fc区的亲和力从纳摩尔到微摩尔不等,对pH的依赖性受到IgG的CH2-CH3铰链区组氨酸残基及与FcRn表面氨基酸残基相互作用的影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用，可显著提高与FcRn的pH依赖性结合，从而保证其在体内具有更长的血浆半衰期，从而大大增强了以CH2结构域为骨架的新型单域抗体药物在体内应用的效果。

为实现上述目的，本发明提供了一种与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体，它是以人抗体IgG恒定区CH2结构域突变体m01s为骨架，将m01s氨基酸序列中的第14位、第15位、第17位、第19位、第21位、第70位的氨基酸进行突变，构建突变CH2结构域骨架的多肽及蛋白质文库，然后以重组人FcRn蛋白为靶标，进行流式细胞分选获得。