[发明专利]一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法

说明书

本发明公开了一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法，所述方法是将米曲霉脂肪酶基因导入毕赤酵母中获得重组毕赤酵母基因工程菌，将重组酵母基因工程菌进行发酵培养，将发酵液分离提取，获得米曲霉脂肪酶。重组毕赤酵母工程菌的胞外表达的米曲霉脂肪酶可以应用于高效催化制备手性APP类除草剂的关键中间体R‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸乙酯((R)‑EHPP)和R‑2‑苯氧基丙酸乙酯。

(一)技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组毕赤酵母异源表达米曲霉脂肪酶的方法及其应用。

(二)背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3)属于ɑ/β水解酶家族，它能催化水解、酯化、酯交换等多种反应，在食品、洗涤、制革、饲料、制药等领域应用广泛。脂肪酶的来源主要有动物、植物和微生物，其中微生物来源的脂肪酶具有催化活性多样性、稳定性好、高产量、可批量生产等优点，因此微生物来源的脂肪酶应用更广泛。据估计，细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属的微生物均可产脂肪酶。来源于洋葱伯克霍尔德菌、荧光假丝单胞菌、米黑根毛霉、疏棉状嗜热丝孢菌、皱褶假丝酵母和南极假丝酵母的脂肪酶是目前常见的商品脂肪酶。

米曲霉来源的基因在酵母里表达，目前国内外主要研究的是米曲霉糖苷酶和蛋白酶基因在酵母里的表达，对米曲霉脂肪酶基因的研究比较少。日本Jinichi Toida研究组对米曲霉脂肪酶的酶结构、性质和编码基因方面进行了较为深入的研究，研究的比较多的是L1(cutinase)、L2(mono-and diacylglycerol lipase)和L3(triacylglycerol lipase)。本课题组前期通过大量产脂肪酶微生物的筛选，获得高脂肪酶活性的米曲霉菌株WZ007，对其进行微生物菌种诱变改造、产酶条件和酶学性质等系统研究，并成功应用于生物素手性中间体内酯、R-硫辛酸和手性农药中间体R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯((R)-EHPP)的高效拆分制备与短链香料酯催化合成等反应中。

当前我国使用的手性农药约占总农药的40％左右，各国的农药工作者也都十分关注和重视光学活性农药的研究。APP类除草剂是具有高药效的单一异构体典型代表，在手性农药中占有相当大的比例。目前，合成这种手性中间体的方法主要是化学合成法，但反应条件苛刻、环境污染大、纯度不高。生物酶法能够克服化学法合成的一些合成的不足，本课题组前期成功利用米曲霉WZ007冻干菌粉生物制备(R)-EHPP的光学纯度达到99.0％以上。因此，构建一种成熟的异源分泌表达系统，使米曲霉脂肪酶基因能够得到高效表达具有很大的现实意义和发展前景。

目前，脂肪酶的生产主要采用异源蛋白表达的策略。异源蛋白表达时的影响因素有很多，主要分为两大类：外因和内因。外因有培养基、培养条件等；内因有基因密码子偏爱性，基因拷贝数、载体的性能等。巴斯德毕赤酵母表达系统是一种成熟高效的真核表达系统，它不仅具有原核表达系统繁殖迅速、费用低廉及操作方便的特点，还具有真核表达系统能对表达的目的蛋白进行正确加工、折叠及适度糖基化的优点，由于对营养要求低，培养基成份简单廉价，可进行高密度高产量的发酵培养，满足工业化生产的需求。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种重组毕赤酵母高效分泌米曲霉脂肪酶的方法及其应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明提供一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法，所述方法是将米曲霉脂肪酶基因导入毕赤酵母中获得重组毕赤酵母基因工程菌，将重组酵母基因工程菌进行发酵培养，将发酵液分离提取，获得米曲霉脂肪酶。

进一步，所述米曲霉脂肪酶基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33。