[发明专利]一种在T细胞中具有高转录活性的嵌合启动子

权利要求书

1.一种增强的启动子序列，其特征在于，所述增强的启动子序列由增强子sDTS和与该增强子可操作地连接的启动子组成，其中，所述增强子sDTS的序列如SEQ ID NO:1所述；所述增强子位于所述启动子的5’端或3’端，优选位于5’端。

2.如权利要求1所述的增强的启动子序列，其特征在于，所述启动子选自：EF1α启动子、PGK启动子、β-actin启动子、hCMV启动子、EEF2启动子、CAG启动子、U6启动子和SV40启动子；优选地，所述启动子为EF1α启动子、hCMV启动子或β-actin启动子；更优选地，所述启动子为EF1α启动子；

优选地，所述EF1α启动子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:3所示；所述hCMV启动子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:4所示；所述β-actin启动子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:5所示。

3.一种核酸构建物，所述核苷酸构建物含有权利要求1或2所述的增强的启动子序列；

优选地，所述核酸构建体是一表达框，从5’端到3’端依次含有可操作性连接的所述增强的启动子序列、感兴趣蛋白的编码序列以及转录终止子。

4.一种载体，所述载体含有权利要求1或2所述的增强的启动子序列。

5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体是真核表达载体，选自：瞬时表达载体、病毒表达载体和转座载体；

优选地，所述载体是用于将感兴趣的基因的表达框整合到宿主细胞的基因组中的载体，优选是转座载体；优选地，所述转座载体含有选自piggybac、sleeping beauty、frogprince、Tn5或Ty的转座元件。

6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，在所述转座载体的5’LTR和3’LTR之间依次含有可操作性连接的所述增强的启动子、一个或多个限制性内切酶的酶切位点或任选的感兴趣的编码序列、以及转录终止序列；

优选地，在所述3’LTR的3’端还可操作性地连接有转座酶的编码序列及其启动子序列；

优选地，所述载体的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；

优选地，所述转录终止序列是SV40polyA转录终止序列。

7.如权利要求5或6所述的载体，其特征在于，

所述感兴趣的基因为PD-1单链抗体的编码序列；和/或

所述酶切位点选自：AscI酶切位点、XbaI酶切位点、PvuI酶切位点、EcoRI酶切位点和SalI酶切位点。

8.权利要求1或2所述的增强的启动子序列在驱动外源基因在T细胞内的表达中的应用。

9.一种T细胞，其含有权利要求1或2所述的增强的启动子序列或权利要求3所述的核酸构建物或权利要求4-7中任一项所述的载体；

优选地，所述T细胞的基因组中整合了以权利要求1或2所述的增强的启动子序列作为启动子以驱动感兴趣外源基因表达的表达框。

10.一种稳定地表达抗体的T细胞，其特征在于，所述T细胞的基因组中整合了含有权利要求1或2所述的增强的启动子序列及与该启动子序列可操作性连接的抗体的编码序列的表达框；

优选地，所述抗体选自：PD-1抗体，PD-L1抗体，CTLA4抗体，CD40抗体，CD40L抗体，CD47抗体，CD137抗体，CD28抗体，CD27抗体，OX40抗体，DNAM-1抗体，GITR抗体，ICSOS抗体，2B4抗体，CD160抗体，TIM3抗体，LAG3抗体，BTLA抗体和TIGIT抗体；

更优选地，所述抗体为PD-1抗体；优选地，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:11所示。