[发明专利]一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法

说明书

本发明公开了一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，步骤为：1）制备海绵支架材料，并检测其力学特性，利用生物3D打印技术将海绵加入到多孔板内，通过24h的冻干过程，再进行紫外灭菌2h以得到用于构建胶质瘤的三维组织支架；2）将人胶质瘤细胞用培养基混匀后3D打印到海绵支架材料上，然后在含有10%FBS培养液中培养7天，制备成三维胶质瘤组织工程化单元；3）检测三维胶质瘤组织的细胞活性和糖胺聚糖分泌量；4）采用生物等效性组化方法检测2D及3D第7天时的生长状态。其优点在于：本发明有效促进胶质瘤组织功能的形成，为脑组织工程的科学研究以及脑癌的临床治疗提供有益的参考，并且为生物打印技术的临床化提供有效的方法及技术支撑。

技术领域

本发明属于生物学和组织工程学技术领域，具体涉及一种基于构建三维胶质瘤组织的方法。

背景技术

药物研发需要经过体外及体内实验，胶质瘤细胞在传统的2D培养中在药物筛选及组织工程已经具有广泛的研究和应用，但2D培养体系在长期的培养过程中存在细胞形态及功能上的缺失，许多指标无法客观评价，至今依然是需要攻克的难题。3D培养系统能更好的模拟细胞在人体的生长环境，具有比2D更加完善的培养体系，正广泛应用于各个领域。

3D培养体系需要借助不同的生物材料来实现，胶原、纳米材料等生物支架材料在组织工程中均具有广泛的应用。细胞生长需要一定的机械强度，海绵支架材料具有良好的吸水性和机械性能。组织工程得到的微型胶质瘤组织具有比2D更好的形态和功能上的优势，细胞与细胞间能形成紧密联系和彼此融合，形成具有一定肿瘤特性的胶质瘤组织。其更加完善的功能可用于体外药物筛选和评价以及3D打印方向的应用。

综上所述，脑癌组织工程领域迫切需要开发一种新的构建胶质瘤组织的方法，在能够有效达到培养胶质瘤组织目的的同时，还能成功取代市场上常用的基于免疫缺陷老鼠的PDX模型。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种可靠、操作简便、可重复性强，能够有效促进胶质瘤组织功能的形成的一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其创新点在于：包括以下步骤：

(1)制备海绵支架材料，并检测其力学特性，然后利用生物3D打印技术将海绵加入到多孔板内，通过24h的冻干过程，再进行紫外灭菌2h以得到用于构建胶质瘤的三维组织支架；

(2)将人胶质瘤细胞用培养基混匀后3D打印到步骤(1)中制备的海绵支架材料上，然后在含有10％FBS培养液中培养7天，即制备成三维胶质瘤组织工程化单元，保存备用；

(3)检测步骤(2)中制备的三维胶质瘤组织的细胞活性和糖胺聚糖GAG分泌量；

(4)采用生物等效性组化方法检测2D及3D第7天时的生长状态。

进一步的，所述步骤(1)中的海绵支架材料的制备具体方法为：首先称取20g鸡、鸭、牛、羊、猪、马等动物皮肤组织，尽量将组织剪成小块，以2％至8％的碳酸钠溶液超声脱脂，控制温度在30℃以下，用纯水洗涤去除残留的碳酸钠；将脱脂后的皮肤用破壁机打碎后再浸泡于500mL 1M醋酸中，加入1-5g胃蛋白酶消化2-3天，过滤，向粗提液中加入10％氯化钠盐析，充分搅拌后将得到白色胶原沉淀，将白色胶原沉淀复溶于0.5M醋酸溶液中，使用3500KDa的透析袋以纯水为外液透析2-3天，得到胶原液，将胶原液置于玻璃器皿中预冻过夜，然后冻干48h后即可得到海绵支架材料。

进一步的，所述步骤(1)中的胶质瘤的三维支架构建的具体方法为：称取2g海绵复溶于360mLpH＝3的稀盐酸中以得到均匀分散液，加入40mL 0.5％的纳米纤维素与分散液充分混匀后再利用3D打印技术精确打入孔板内，每孔容量100至600μL，预冻后冻干24h即可得到2-4mm左右厚度的海绵支架材料，紫外灭菌2h后即可得到构建胶质瘤的三维组织支架。