[发明专利]分析用试样的调制方法以及分析方法

说明书

本发明的分析用试样的调制方法中，依次实施修饰或除去糖肽或糖蛋白的肽部分中所含的至少1个伯氨基的第一反应以及可修饰糖链的唾液酸的羧基的第二反应。第二反应是α2，3‑唾液酸和α2，6‑唾液酸生成质量不同的衍生物的反应。

技术领域

本发明涉及糖肽或糖蛋白的分析用试样的调制方法以及分析方法。

背景技术

向肽链附加糖链是翻译后修饰中最重要的工序之一。肽链上附加有糖链的糖蛋白与各种各样的生命现象相关。一般认为，在生物体内，通过附加在蛋白质上的糖链的细微结构差异被精密识别，细胞间的信号传导和分子识别等得到控制，由此，糖蛋白质及糖肽的结构解析被期望会给生命现象的阐明、新药创制、生物标志物开发等方面带来巨大贡献。

蛋白质上所结合的糖链大多具有唾液酸。由于糖链的唾液酸直接参与分子识别，故而分析唾液酸的有无(唾液酸的数量)及其结合模式在糖蛋白和糖肽的结构解析中是重要的。

关于糖链中的唾液酸，与还原末端侧的糖残基的结合方式存在着α2，3-结合者和α2，6-结合者(结合异构)。已知在生物体中，唾液酸的结合方式的差异与各种各样的生命现象相关，例如已知随着癌化，唾液酸的结合方式会产生变化。因此，识别唾液酸的结合方式的差异，在作为生物标志物的利用和生物医药品的质量管理等方面也受到关注。

作为识别糖链中的唾液酸的结合方式的方法，有人提出了下述方法：按照根据唾液酸的结合方式而具有不同的质量的方式进行衍生物化，进行质量分析的方法。例如，专利文献1中，有人提出了下述方法：在使用1-甲基-3-对甲苯基三氮烯(MTT)进行唾液酸的甲酯化后，设定为酸性条件的方法。该方法中，由于在酸性条件下α2，3-唾液酸的甲酯被选择性地脱甲基化，故而由α2，3-唾液酸与α2，6-唾液酸获得了质量不同的衍生物。非专利文献1以及非专利文献2公开了下述内容：通过在脱水缩合剂和甲醇或乙醇等亲核剂的存在下使糖链反应，由此α2，6-唾液酸藉由与亲核剂的反应从而羧基被酯化，α2，3-唾液酸藉由分子内脱水从而生成内酯环。非专利文献3以及专利文献2公开了下述内容：通过在脱水缩合剂以及作为亲核剂的胺的存在下的反应，α2，6-唾液酸藉由与亲核剂的反应从而羧基被酰胺化，α2，3-唾液酸藉由分子内脱水从而生成内酯环。

藉由α2，3-唾液酸糖链的分子内脱水而生成的内酯是不稳定的，有时候会出现由于与MALDI-MS的基质的混合而内酯开环，分析的定量性受损的情况。专利文献2中，在脱水缩合剂(N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)等碳二亚胺)以及异丙胺的存在下的反应之后，在鏻(phosphonium)系脱水缩合剂和甲胺的存在下，进一步实施反应，内酯开环，进行甲酰胺化。像这样地，通过将由α2，3-唾液酸糖链生成的内酯进行开环而生成更稳定的衍生物，可以提高分析的定量性。

[现有技术文献]

[专利文献]

专利文献1：日本专利特开第2013-76629号公报

专利文献2：日本专利特开第2016-194500号公报

[非专利文献]

非专利文献1：Wheeler，S.等，Rapid Commun.Mass Spectrom.，第23卷，第303-312页(2009年)

非专利文献2：Reiding,K.等，Anal.Chem.，第86卷，第5784-5793页(2014年)

非专利文献3：de Haan,N.等，Anal.Chem.，第87卷，第8284-8291页(2015年)

发明内容

[发明所要解决的问题]