[发明专利]适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法

说明书

本发明公开了一种适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，包括：步骤一、于温度4℃下，取三七材料粉末，加入不含酚类的蛋白质裂解液，超声，离心得到上清液；步骤二、2.1)将上清液与第一抽提液混匀，‑20℃静置1小时，离心，取下层沉淀，得到第一沉淀；2.2)将第一沉淀与第二抽提液混匀，然后于4℃、12000r/min转速条件下离心30min，取下层沉淀，得到第二沉淀；2.3)将第二沉淀干燥，之后溶于iTRAQ标记液中，再次离心取上清液，该上清液即为适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白。本发明工艺简单，蛋白得率高、纯度高，可应用于三七根茎蛋白质组差异定量分析。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法。

背景技术

中药材三七是五加科人参属植物三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根和根茎，为《本草纲目》、历届《中国药典》等经典文献收录，具有重要的药用和保健价值，能散瘀止血，消肿定痛，补益健体，有“国药明珠”、“止血仙草”、“南人参之王”等美誉。现代药理研究，三七主要活性成分以三七总皂苷为主。因此，明确三七总皂苷的生物合成途径是实现三七次生代谢工程和品质遗传改良的重要基础。而蛋白质是生命的基石，蛋白酶是代谢调控的关键。基于蛋白质组差异定量的代谢研究是三七皂苷生物合成代谢工程及品质育种的热点和前言，但迄今为止，尚无相关研究报道。

蛋白质样品的质量直接影响下一步蛋白质组学分析。采用传统的酚法进行三七根和茎组织中蛋白质提取，易受体内色素、酚类、醌类等其他次生代谢产物的影响，得到的蛋白质质量不佳，不能真实有效地从蛋白组学水平上解释三七皂苷代谢的作用机制。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明另有一个目的是提供一种适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，实现三七根茎总蛋白质的高效提取，获得蛋白质纯度高，可应用于蛋白质组差异定量分析。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法，包括如下步骤：

步骤一、于温度4℃下，取三七材料粉末，加入不含酚类的蛋白质裂解液，于超声功率150～210W下超声8～12分钟，其中，每超声1～3s，停2～4s，离心得到上清液；

步骤二、2.1)将步骤一中得到的上清液与第一抽提液混匀，-20℃静置1小时，之后于4℃、12000r/min转速条件下离心30min，取下层沉淀，得到第一沉淀；

2.2)将所述第一沉淀与第二抽提液混匀，然后于4℃、12000r/min转速条件下离心30min，取下层沉淀，得到第二沉淀；

2.3)将所述第二沉淀真空干燥1h或者于真空浓缩仪中干燥20～30min，之后将所述第二沉淀溶于iTRAQ标记液中，再次离心取上清液，该上清液即为适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白；

其中，所述蛋白质裂解液包含：0.02～0.08M三羟甲基氨基甲烷，1.2～1.8M氯化钠，0.001M苯甲基磺酰氟，0.001M乙二胺四乙酸二钠，0.08～0.12％(w/v)乙基苯基聚乙二醇，0.08～0.12％(w/v)脱氧胆酸钠，0.08～0.12％(w/v)十二烷基硫酸钠和0.0001M亮肽素。

优选的是，所述的适于蛋白质组差异定量分析的三七根茎总蛋白的提取方法中，所述步骤一中，所述三七材料粉末与所述蛋白质裂解液的质量体积比为1:1～2。