[发明专利]一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白，所述融合蛋白由抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体组成，其具有能够分别识别VEGF和EGFR的两组独特的CDR区序列，对VEGF和EGFR具有高度特异的的识别能力，且具有优异的肿瘤结合效果和肿瘤定位效应。本发明还公开了偶联了指示剂的所述双特异抗体融合蛋白在制备体外肿瘤诊断试剂和体内生物成像剂中的应用。偶联上核磁和荧光显像剂的双特异抗体融合蛋白，可以在体内进行肿瘤成像。而且该抗体融合蛋白的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。

技术领域

本发明公开了一种抗体蛋白，更具体地，本发明公开了一种双特异抗体融合蛋白。

背景技术

肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。

肿瘤的临床诊断技术也在逐渐提高。从最初的肿瘤标记物的检测、超声、透视等手段，发展到现在更多的肿瘤相关因子的蛋白水平和分子水平的检测、CT、核磁、PET、SPET，以及肿瘤微创的活检等等技术都已在临床上广泛应用。

肿瘤的诊断分为体外和体内诊断。在体外，肿瘤组织的免疫组织化学染色是确诊肿瘤的一个重要指标。体内诊断，一般是利用一些显像剂再辅助一些仪器进行肿瘤成像。肿瘤体内成像不仅能够早期诊断肿瘤，而且能够实时监测抗肿瘤治疗的效果以及肿瘤的进展情况。因为它是无创检查，给病人带来的痛苦小，已经成为临床确诊和治疗肿瘤的必不可少的诊断手段。目前医院常用的肿瘤体内显像使用的是放射性核素显像，以及核磁。

近年来，光学成像以其非侵袭性、实时、分辨率高等优势广泛应用于肿瘤研究领域，可对肿瘤进行早期诊断，反映肿瘤解剖学结构及代谢情况。近红外荧光成像是目前光学分子成像领域研究的热点，其光谱范围为700-1000nm，在此波段范围内被监测的生物体与组织的自发荧光干扰较小，穿透组织距离可高达数厘米，提高了成像的准确度和灵敏度。

随着肿瘤靶点不断增多，利用特异性针对肿瘤靶抗原的抗体作为指示剂的研究也在逐渐深入。但是传统的全分子抗体分子量较大，并不能很快分布到全身，也不能很好地结合一些被遮蔽的靶位，所以抗体作为指示剂的可行性大打折扣。但是基因工程技术创造出了仅有抗原结合功能的分子量小的抗体片段，使得这一设想得以实现。

如果将特异性针对肿瘤靶点的抗体偶联上顺磁性阳性造影剂和近红外荧光染料，这样可以同时适用两种临床诊断手段，一种通过核磁，另一种通过激光激发。不仅增加了核磁的确诊率，而且通过激光激发出的红色荧光还可以应用到手术导航中，为临床肿瘤的确诊提供了一个新的方法，而且也为手术切除肿瘤提供了一个助判手段。

用来确诊肿瘤的靶点通常都是细胞表面蛋白。血管内皮生长因子(VEGF)也可以作为一个肿瘤诊断的靶标，VEGF是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，普遍表达于人体的表皮细胞和基质细胞，并在多种人类恶性肿瘤中存在高表达，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、粘附、侵袭和转移。EGFR信号传导关乎细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环，与肿瘤的形成和恶化息息相关。通过阻断EGFR与其配体的结合可以抑制EGFR向胞内的信号传导，从而起到抑制肿瘤细胞生长、迁移的效果。