[发明专利]一种检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质的方法

说明书

本发明公开了一种检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质的方法，采用KRKC和GSH两种多肽作为稳定剂合成表面带有正电荷具有荧光特性的金纳米簇作为荧光探针，利用所述荧光探针分别与肝素钠标准品溶液和含有多硫酸软骨素类杂质的肝素钠溶液混合后，具有不同的荧光增强效果这一特性，对肝素钠产品中的多硫酸软骨素杂质进行检测和测定。提供一种高效快速检测肝素钠中是否含有多硫酸软骨素的方法。本方法具有成本低、灵敏度高、快速高效、操作性强等优点，可以实现肝素钠中是否含有多硫酸软骨素杂质的快速的检测。

技术领域

本发明属于功能性纳米材料技术应用领域，涉及一种以金纳米簇为荧光指示剂检测肝素钠中多硫酸软骨素杂质的方法，具体涉及利用一种采用KRKC和GSH两种多肽作为稳定剂合成表面带有正电荷可以产生荧光的金纳米簇作为荧光探针，利用此探针分别与肝素钠溶液和多硫酸软骨素溶液混合后，具有显著不同的荧光增强效果这一特性，利用金纳米簇的荧光变化程度，对肝素钠产品中含有的多硫酸软骨素杂质进行检测。

背景技术

肝素钠(Heparin sodium)是一种常见的血液抗凝剂，它是由带有负电荷的二糖单元连接而成的聚合物，是一种硫酸氨基聚糖的钠盐，主要是从健康猪小肠粘膜中提取的精制的一种粘多糖类药物，被广泛应用于治疗静脉血栓和预防凝血等医疗领域。2008年，中国出口到美国的肝素原料药和最终成品出现质量问题，导致多名病患出现了过敏反应和其他的副作用，对病患的身体健康和医院的正常的医护造成了不良影响。经过有关部门的调查，这次事件的原因是肝素钠中掺杂有结构类似的多糖类杂质多硫酸软骨素(Over-sulfatedchondroitin sulfate,OSCS)。由于包括硫酸软骨素在内的多种杂质多糖分子的结构、分子量、电荷密度、抗凝活性与肝素钠十分的相似，这对糖类杂质的鉴定与检测造成了一定的难度。因此，如何快速准确的鉴定出肝素钠中所含有的多硫酸软骨素类多糖杂质，是提高该药品检测水平的关键，也是提高药品安全性和病患人身安全的关键。相关的检测方法和规定也上升至中国药典和美国药典质量标准。

目前，对于肝素钠的鉴定主要有毛细管电泳(CE)、核磁共振(NMR)、以及色谱法等方式。毛细管方法可以测试肝素钠中是否含有多硫酸软骨素，但是由于该方法图谱主成分峰和多硫酸软骨素尖峰不能完全的分离，有可能会造成误判。据国外文献报道核磁共振氢谱(1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR)从OSCS污染的肝素中可以检测到异于肝素的N-乙酰基甲基峰，通过检测这一特征峰可以判断肝素中是否含有OSCS污染物。另外，国外的研究团队对强阴离子交换高效液相色谱(strong anion exchange-high performanceliquid chromatography，SAX-HPLC)检测肝素中OSCS含量的方法进行了相关的研究。但是这些方法都对仪器要求较高，成本昂贵，因此开发出一种简单准确高效的区分肝素钠和其他糖类杂质的方法具有迫切的市场需求及良好的社会效益。

金属纳米簇是介于金属原子和纳米粒子之间的一类新型材料，具有较强的荧光发射、良好的稳定性以及较好的生物相溶性等优点，可应用于生物小分子检测领域。如中国发明专利CN104865235B公开了一种基于原位制备的荧光银纳米簇检测葡萄糖浓度的方法，采用制备的荧光银纳米簇荧光发射轻度与葡萄糖浓度建立定量关系，从而实现葡萄糖浓度的检测。中国发明专利CN104330393B公开了以金纳米簇为荧光探针的葡萄糖检测方法。上述两种方法都是采用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H₂O₂,Fe²⁺催化H₂O₂产生自由基使金纳米簇的荧光发生淬灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，这些检测方法只是针对单一的糖类进行检测，不能对结构相似的不易区分的两种多聚糖进行区分，针对这一难题，我们设计能够实现对肝素钠、多硫酸软骨素进行不同荧光响应的金纳米簇来实现对肝素钠中的含有的杂质多硫酸软骨素进行定性与定量的检测，该方法具有简单、方便快捷等优点。

发明内容