[发明专利]一种真皮成纤维细胞规模化生产系统

说明书

技术领域

本发明总体上涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种成人自体真皮成纤维细胞的规模化生产系统。

背景技术

目前细胞代替疗法正在国内外逐步展开。在临床皮肤疾病和创伤治疗领域，如皮肤缺损治疗、皮肤抗衰老治疗、人工皮肤等领域，除了通用化药治疗以为，临床医师正在尝试使用生物活性药品或制剂，包括细胞制剂及其衍生品。

细胞制品，在细胞的取材方面，自体细胞免疫原性低，最容易被使用者接受，进入临床使用。自体细胞取材部位、取材面积、生产速度、产品活力和纯度，直接关系细胞产品的生产时间和产量。国内外经过多年研究，已经产生了多种培育人体皮肤细胞的方法，但各家做法方法不一，培育质量也参差不齐。

本发明对皮肤成纤维细胞活体取材部位、手术及组织消毒方法、原代培养方法、细胞表型筛选、细胞成品鉴定、生产全过程质检系统，进行了更新改进，得到稳定的取材量-细胞获得量关系，以及稳定生产的方法。该方法可以在近乎稳定的时间内获得高纯度、高质量的、稳定产量的I型真皮成纤维细胞。

发明内容

本发明的一个方面，提供了成人自体真皮成纤维细胞的生产方法，包括活组织消毒和运输方法、真皮组织包埋培养方法，细胞表型筛选方法、细胞鉴定方法。

本发明提供了一种真皮成纤维细胞的生产方法，包括以下步骤：

(1)采集皮肤活组织，其中包括手术区消毒过程和组织消毒过程，在所述手术区消毒过程中使用的消毒方式包括酒精或碘伏擦拭采集的皮肤活组织，在所述组织消毒过程中使用的消毒方式至少包括清洗液淋洗真皮部位。

在一个实施例中，上述真皮成纤维细胞的生产方法还包括以下步骤：

(2)原代细胞分离和培养；

(3)细胞表型筛选，其中选择I型成纤维细胞进行下一步操作；

(4)扩大培养和收集细胞。

在本发明的一个实施例中，在步骤(1)中，所述手术区消毒过程中使用的消毒方式包括酒精擦拭和碘伏擦拭。

在本发明的一个实施例中，在步骤(1)中，所述组织消毒过程中使用的消毒方式还包括酒精擦拭表皮层和清洗液淋洗真皮部位。

在本发明的一个具体实施例中，在步骤(1)中，使用的消毒组合为：手术区通过酒精擦拭和碘伏擦拭消毒，组织通过酒精擦拭表皮层和清洗液淋洗真皮部位的方式消毒。

在本发明的一个具体实施例中，在步骤(1)中，手术区消毒3遍，组织被消毒3次。

在本发明的一个实施例中，在步骤(3)中，细胞表型筛选后，进行表型检测、流式检测和蛋氨酸检测,其中所述表型检测优选通过吉萨姆染色后显微镜观察形态确定，所述流式检测优选通过成纤维细胞阳性标志物阳性率大于95％和阴性标志物阴性率小于5％确定。

在本发明的一个实施例中，所述成纤维细胞阳性标志物选自CD73、CD90、和CD105所组成的组，所述成纤维细胞阴性标志物基因选自CD31和CD34所组成的组。

在本发明的一个具体实施例中，所述成纤维细胞阳性标志物为CD73、CD90、和CD105，所述成纤维细胞阴性标志物基因为CD31和CD34。

在上述的生产方法中，在步骤(2)中，所述原代细胞培养的方法为胶原包埋组织培养法：在培养容器中预铺一定厚度一定浓度的胶原蛋白，将组织块完全埋入胶原中，再胶原上层加入培养基，静置培养。

在上述的生产方法中，在步骤(2)中，所述的原代细胞培养中使用的培养基配方为DMEM高糖培养基、15％FBS、1％NEAA、1％L-谷氨酰胺、和1％丙酮酸钠。

在上述的生产方法中，在步骤(2)中，其中，经过原代组织采集获得的细胞，通过病毒检测和微生物检测后，确定该细胞是否可用于后续的细胞原代培养还是废弃。

其中，检查项目包括微生物安全性检测(诸如细菌检测、真菌检测、支原体检测、内毒素检测)和病毒检测(诸如HIV、HBV、HCV、CMV、TP)检测，抽检样本为组织提供者的血液。所有检测结果必须为阴性。

在上述的生产方法中，在步骤(4)中，其中，经过扩大培养后的细胞，通过微生物检测，合格的被收集，不合格的废弃。

附图说明

图1示出细胞生产流程图。

图2示出细胞生产数量和时间曲线图。

图3示出不同表型的成纤维细胞的形态图(物镜光学倍数4倍)。

图4示出接种组织后不同天数后细胞形态图(物镜光学倍数10倍)。

图5示出原代细胞包埋式培养细胞状态图(物镜光学倍数4倍)。

图6示出细胞标志物鉴定的流式细胞图。