[发明专利]沙棘GPD1基因的构建方法

说明书

本发明涉及沙棘GPD1基因的构建方法，属于生物工程技术领域。该基因的构建和鉴定方法如下：(1)提取沙棘果肉RNA，并获得GPD1基因cDNA；(2)构建沙棘GPD1基因过表达载体；(3)利用沙棘GPD1基因过表达载体转化农杆菌；(4)利用pBI121‑T‑GPD1重组表达载体转化烟草；(5)转化烟草的分子检测；(6)测定烟草叶片含油率。本发明首次从沙棘果肉中分离获得GPD1基因，并通过构建过表达载体及农杆菌介导法成功转化烟草，使烟草叶片油脂含量提高28％。为沙棘果肉以及植物非种子组织油脂合成积累机制研究提供技术依据。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及沙棘GPD1基因的构建方法。

背景技术

木本油料的开发利用是缓解当前食用油供应不足且耕地逐渐减少的有效途径。沙棘是重要的生态经济树种，果实油脂中富含omega-3、omega-6和omega-7脂肪酸，在预防和治疗癌症、冠心病和胃肠疾病等方面具有显著疗效，但较低的含油率(种子为7～11％，鲜果肉为1～5％)制约了沙棘油的高效开发和利用。

沙棘油脂的主要成分是甘油三脂(Triacylglycerols，TAG)，TAG合成的关键原料是3-磷酸甘油(glycerol-3-phosphate，G3P)，而G3P是由糖酵解的中间产物磷酸二羟丙酮被3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol-3-phosphatedehydrogenase，GPD1)还原而来，例如Vigeolas等从酵母中分离GPD1基因，通过调控种子特殊启动子活性，使GPD1活性增加2倍，油菜种子中的G3P水平增加3～4倍，种子含油量提高40％(PlantBiotechnologyJournal.2007,5:431-441)。目前，GPD1的功能研究多基于酵母、菌类和草本植物等试验材料，而在木本植物，尤其沙棘中的研究罕见，如沙棘GPD1基因序列、载体构建、遗传转化和功能分析均未见报道，而且种子油脂合成和积累机制也仍存在许多未知，如油脂合成关键基因在相对贡献、代谢流调节及代谢物在不同组织间转运等。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供沙棘的GPD1基因的构建方法如下：

(1)提取沙棘果肉RNA，并获得GPD1基因cDNA；

(2)构建沙棘GPD1基因过表达载体；

(3)利用沙棘GPD1基因过表达载体转化农杆菌；

(4)利用pBI121-T-GPD1重组表达载体转化烟草；

(5)转化烟草的分子检测；

(6)测定烟草叶片含油率。

进一步的，步骤(3)：农杆菌感受态细胞制备过程中，采用含有100mg/L链霉素和100mg/L利福平的发根农杆菌培养基，在冻融法转化农杆菌过程中，采用含有100mg/L链霉素(Str)、100mg/L利福平(Rif)和50mg/L卡那霉素(Kan)的发根农杆菌培养基(YEB)。

进一步的，步骤(4)转化烟草过程中使用的MS预培养固体培养基组成为：4.74g/LMS培养基粉末、30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉、0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.1mg/Lα.萘乙酸(NAA)，pH6.0。

进一步的，步骤(4)转化烟草过程中使用的分化培养基组成为：4.74g/LMS培养基粉末、30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉、0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.1mg/Lα/萘乙酸(NAA)、50mg/L卡那霉素(Kan)、500mg/L羧苄青霉素(Car)，pH6.0。