[发明专利]一种工业化生产凝乳酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品深加工技术领域，具体地说涉及一种工业化生产凝乳酶的方法。

背景技术

凝乳酶chymosin一般也称为rennin,是一种蛋白酶，目前来源有小牛皱胃酶、植物提取物、微生物来源。

凝乳酶是干酪制作过程中首要催化剂，起到不可或缺的作用，传统工艺中选择动物来源的小牛皱胃酶，但是该来源的酶供不应求，价格昂贵，产量有限，随着生物技术的发展，不少研究者从产凝乳酶菌株中获得凝乳酶，通过微生物的高密度发酵制得凝乳酶，来取代小牛皱胃酶，成为该产业中凝乳酶的供应者。

总体来说，动物来源的凝乳酶生长比较慢，来源有限；植物来源的凝乳酶有较高的蛋白水解活性和本身有毒，所以未出现大规模的商业化应用；微生物来源的凝乳酶来源广泛，目前有几十种微生物可用来发酵生产凝乳酶，主要涉及放线菌，细菌和真菌等等；微生物发酵成本低廉，安全无毒，产量大等优点被广泛使用。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的缺陷，提供一种工业化生产凝乳酶的方法，利用细菌-大肠杆菌发酵生产凝乳酶，具有周期短，成本低，易纯化，酶活力高，产业化简单等优势。凝乳酶易纯化，产量大，易规模化生产，可以取代动物来源的凝乳酶，成本低，符合食品酶制剂要求

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

一种工业化生产凝乳酶的方法，该方法的步骤是：

S1、以来源于大肠杆菌K-12的发酵菌株为原始菌株；

S2、传代菌株制备：将原始菌株划线在固体平板上，28-30℃恒温培养箱用固定平板培养基培养24-30小时；

S3、活化液培养：从平板内挑选单菌落分别接入准备好的三角瓶中，用活化培养基培养，28-30℃、180rpm摇床，16-24小时；

S4、种子培养：从活化液中挑选长势较好的菌落转接到大瓶培养，扩大种量，接种量按照1％-2％接种,用种子培养基培养，28-30℃、180rpm摇床培养，活化转接要求OD值为2-5，培养时间8-12h；

S4、发酵种子培养，用饱和蒸汽对发酵种子培养基进行灭菌消毒，降温到35-38℃，接种量按照1％-2％接种，开启搅拌220rpm，调节通气量1:1VVM，氢氧化钠调节PH值控制在6.7-7.5，培养时间8-12h，控制OD值在2-5转接；

S5、发酵培养：按照接种量1％-1.5％接入发酵培养基中，在36-37℃，开启搅拌,通气量按照溶氧条件调节，培养18-24小时；

S6、发酵结束，检测菌体含量、湿重、OD值，放料离心处理，收集得到湿菌体，并计重；

S7、湿菌体MEDT溶解，再用EDTA缓冲液清洗菌体，然后离心收集菌体，计重后用EDTA溶解成悬浮液；

S8、菌体悬浮液在800-1000Bar高压均质机破碎2次以上，检测OD值在50-65左右时，再次离心收集包涵体；

S9、包涵体经过复性，得到粗制凝乳酶液；

S10、粗制凝乳酶液经过膜过滤、加水洗脱，微滤除杂、超滤浓缩、除菌过滤得到无菌液态产品；

S11、根据客户需求用无菌水配制要求的酶活。

作为对上述技术方案的改进，所述发酵培养的具体步骤为：

S5.1、配置发酵培养基，用饱和蒸汽120-122℃灭菌，然后降温到37℃备用；

S5.2、按照接种量1％-1.5％将凝乳酶种子移种发酵培养基中，在36-37℃下开启搅拌，起始通气量500(1:1vvm)M³/h,利用氢氧化钠和盐酸控制PH值在6.7-7.5左右，罐压0.02-0.05Mpa,培养时间4-5h；

S5.3、培养期间检测OD、湿重、氨基氮、甘油含量指标，当OD超过12、湿重超过20g/L时，开始流加二次补料培养基，二次补料培养基与发酵培养基的质量比为10：100；

S5.4、在培养5h-6h时，随二次补料培养基同时流加乳糖补料，流加量为50kg/h，乳糖与与发酵培养基的质量比为10：100；

S5.5、当湿重指标50以上时，一次性加入诱导剂IPTG，开始诱导产酶，诱导剂与发酵液的体积为0.3：1000；

S5.6、当湿重不在增长时中止发酵；

作为对上述技术方案的改进，所述固体平板培养基组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、1.5％琼脂、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。

作为对上述技术方案的改进，所述活化培养基的组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、0.1‰氨苄青霉素，其余为水。