[发明专利]一种艰难梭菌毒素B的化学发光检测试剂盒及其制备方法

说明书

本发明公开了一种艰难梭菌毒素B化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：偶联有艰难梭菌毒素B捕获抗体的磁微粒、吖啶酯标记的艰难梭菌毒素B检测抗体、艰难梭菌毒素B校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B。本发明试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术。本发明试剂盒操作简单方便，反应条件温和，发光值稳定，受外界条件影响少；与现有技术相比，具有灵敏度高、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术领域，具体涉及一种艰难梭菌毒素B的化学发光检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

艰难梭菌最初是在1935年由Hall和O'Tolle发现，但直到1977年证实艰难梭菌与临床上长期使用某些抗菌药物引起的伪膜性结肠炎有关才备受关注。艰难梭菌在肠道黏附繁殖产生毒素，其次毒素对肠道黏膜发挥病理作用。正常肠道菌群具有定植抗力可以抵御病原体黏附。但长期使用抗菌药物，定植抗力减弱，肠道微生物群以及代谢群均发生变化，导致肠道菌群失调，艰难梭菌易于黏附在肠道并释放毒素。

艰难梭菌可产生6种毒素，包括毒素A(tcdA)、毒素B(tcdB)、毒素C(tcdC)、毒素R(tcdR)、毒素E(tcdE)和二元毒素(CDT)，分别是由tcdA、tcdB、tcdC、tcdR、tcdE和CDT基因编码。其主要的毒力因子是毒素A和毒素B，毒素A也称为肠毒素，能引起肠黏膜分泌增多甚至出血；毒素B为细胞毒素，可以刺激单核细胞释放炎性因子，直接破坏肠壁细胞，引起炎性反应进而使肠黏膜细胞变性、凋亡、坏死和脱落。

目前用于检测艰难梭菌毒素B的方法主要有细胞培养法、胶乳凝集试验、胶体金免疫分析法、酶联免疫分析法等。其中，产毒素细胞培养是检测艰难梭菌毒素产生情况，并具有较高的敏感性和特异性，但是因细胞培养技术难度较高，测定时间长，故在常规临床微生物实验室无法普及；乳胶凝集试验用艰难梭菌抗毒素与乳胶微粒交联，然后用抗原抗体结合产生的免疫沉淀来检测毒素，该法假阳性较高，且也存在假阴性，临床使用有一定缺点；CN 101363867A（2009.02）公开了一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用，该方法采用胶体金标记艰难梭菌毒素A、B抗体，胶体金方法的检测是以肉眼可见的颜色进行表征，存在误差较大，操作繁琐、流程较多、灵敏度低、精度不高等缺点；酶联免疫分析法抗原、抗体是在固相（ELISA板反应孔）表面进行结合反应，存在灵敏度低、不易实现全自动化、检测时间长等的缺点。因此，建立一种有效、快速、简单、灵敏、抗干扰性高的检测艰难梭菌毒素B的方法具有十分重要的意义。

本发明以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术进行检测。

吖啶取代物作为化学发光标记物用于免疫分析具有许多优越性，主要有：①化学反应简单、快速、无需催化剂，在有H₂O₂的稀碱性溶液中即能发光；②背景发光低，信噪比高，发光反应干扰因素少；③发光类型为闪光型发光，光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；④吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，可提高系统整体灵敏度；⑤易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑥标记物稳定，不受环境氧化剂的影响，在2-8℃下可保存数月之久。因此吖啶取代物是一类非常有效的化学发光标记物。

磁分离免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体而建立的一种新型免疫检测方法，该方法可使抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简便、灵敏度更高、反应快速、稳定、准确地定量测定艰难梭菌毒素B的磁微粒化学发光测定试剂盒及制备方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：