[发明专利]酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法

说明书

本发明公开了酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：先取脐带组织，然后分离出华通氏胶，接下来将华通氏胶切割成组织匀浆并转入离心管中，按体积比1：1的比例加入预温的0.1％胶原酶I，放入到CO₂培养箱中在37℃条件下进行恒温酶解，每隔20min剧烈震荡一次，当组织块已被酶解成糊状时停止酶解，抽取酶解液贴着400目细胞筛进行过滤，向滤液中补加PBS重悬细胞，离心去上清，再用PBS重悬细胞并离心洗涤，最后用细胞培养液将细胞重悬并转移至T75培养瓶中培养。本发明的有益之处在于：采用较低浓度(0.1％)的胶原酶I进行酶解，不仅减小了对细胞的损伤，同时降低了提取及培养的成本。

技术领域

本发明涉及提取及培养细胞的方法，具体涉及酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是具有自我更新、多向分化、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性的细胞。MSC在连续传代培养和冷冻保存后，仍有多向分化潜能，因此可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤的修复。MSC能分泌产生多种促进生长分化的细胞因子，例如：HGF、IL-6、IGF-1、TGF-α、TGF-β、BDNF、EGF、FGF、SDF-1、和VEGF等，具有免于调控功能。因此，MSC在再生医学领域有重要作用。

MSC最初是在骨髓中发现的，后来发现脐带、脐血、胎盘和其他一些组织中也存在。脐带间充质干细胞(UCMSC)是存在于脐带华尔通胶(Wharton'sjelly)和血管周围组织中的一种干细胞。来源于脐带的间充质干细胞具有取材方便、来源丰富、易于采集和运输、生物学特性稳定、免疫原性低、无异体排斥反应、成本低、对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，所以在未来医疗应用方面具有很大的潜力。

目前，UCMSC的原代分离方法主要有：组织块培养法、酶解法。

组织块培养法的培养周期长，从而加大了培养过程中污染的几率，并且加大了成本。此外，组织块培养法占用空间大，不适于大规模批量化的生产。

酶解法的培养周期短，占用空间小，适用于大规模培养。

但是，现在多数酶解法都是采用较高浓度(0.2％～1％)的胶原酶进行酶解，或者采用胶原酶与胰酶联合进行酶解，都对细胞有损伤。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可减小细胞损伤的提取及培养人脐带间充质干细胞的方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1：取健康产妇39周～40周正常分娩或剖腹产脐带组织；

Step2：从脐带组织中分离出华通氏胶；

Step3：将华通氏胶置于培养皿中，切割成组织匀浆，然后转入离心管中，按体积比1：1的比例加入预温的0.1％胶原酶I，放入到CO₂培养箱中在37℃条件下进行恒温酶解，每隔20min剧烈震荡一次，酶解2h左右观察酶解效果，当组织块已被酶解成糊状时停止酶解，用注射器抽取酶解液贴着400目细胞筛进行过滤，向滤液中补加PBS重悬细胞，300G离心5min，去掉上清，再次用PBS重悬细胞并离心洗涤，最后用细胞培养液将细胞重悬并转移至T75培养瓶中；

Step4：将装有UCMSC的T75培养瓶放置于CO₂培养箱中，在37℃条件下恒温培养，每天观察UCMSC的生长情况，当细胞融合度达到80％时，执行P0～P1传代操作；