[发明专利]一种脾氨肽内多肽的提取方法

说明书

本发明公开了脾氨肽内多肽的提取方法，包括以下步骤，步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B；步骤二，样品处理，将脾氨肽加入到起始流动相中，得到样品溶液；步骤三，分离纯化。本发明具有以下优点和效果：采用色谱分离技术，色谱柱吸附脾氨肽内的多肽、糖、游离氨基酸、核苷酸等物质，梯度洗脱过程中，将多肽从色谱柱上集中洗脱出来；在色谱分离过程中，选用合适的流动相以及色谱柱，能将脾氨肽内的多肽集中洗脱，多个色谱峰之间间隔较大，达到了分离纯化脾氨肽内多肽、分离效果好、操作简单的效果。

技术领域

本发明涉及生物制品领域，特别涉及一种脾氨肽内多肽的提取方法。

背景技术

脾氨肽口服冻干粉属于从脏器提取的生化药，主要成分包括氨基酸、多肽、核苷酸等物质，作为免疫体调节剂，用于反复呼吸道感染、支气管炎、哮喘、肺炎、癌症等病症的辅助治疗。临床观察显示，能够有效提高患者的抵抗力，减少呼吸道感染的发生率，并具有调节细胞免疫的功能，脾氨肽中主要的活性物质为多肽，国家药品标准WS1-(X-002)-2002Z中，测定多肽的含量是控制脾氨肽产品含量的唯一指标，将脾氨肽内的多肽分离纯化后，对于研究脾氨肽作为免疫调节剂的作用机制，以及将分离的多肽作为冻干粉制剂以显著提高药品的活力，都具有显著的作用和意义，因此，有必要提出一种脾氨肽内多肽的提取方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种脾氨肽内多肽的提取方法，具有分离脾氨肽内多肽的效果。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种脾氨肽内多肽的提取方法，包括以下步骤步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B，流动相A内溶剂为水、溶质为质量百分比浓度为0.1％的甲酸，流动相B内溶剂为乙腈、溶质包括质量百分比浓度为0.1％的甲酸和质量百分比浓度为0.1％的环己醚；步骤二，样品处理，将脾氨肽加入到起始流动相中，得到样品溶液；步骤三，分离纯化，色谱条件：色谱柱选用Agilent Poroshell300SB-C18,色谱柱内填料颗粒为多孔硅胶，填料颗粒直径为5μm，色谱柱内径为2.1mm，柱长为75mm，柱温40℃，梯度洗脱0min-13min-13.5min-26min-35min,流动相B5％-11.2％-15.8％-36％-60％；流速0.5ml/min，进样体积为20μL，检测波长214nm，收集出峰时间为16.060-16.462min、23.072-24.022min、29.968-31.451min的色谱峰，得到分离出来的多肽。

通过采用上述技术方案，色谱分离是一种分离复杂混合物中各种组分的有效方法，利用不同物质在固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当流动相和固定相相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复的分配，从而使各组分达到分离。

脾氨肽内主要组分包括多肽、游离氨基酸、核苷酸、糖，本申请采用色谱分离技术从脾氨肽内分离纯化出多肽，色谱分离的条件中，选用硅胶柱作为色谱柱，流动相A内溶剂为水，溶质为甲酸，流动相B内溶剂为乙腈，溶质为甲酸和环己醚，采用梯度洗脱的方法，0-13min时，流动相组分内包括95％的流动相A和5％的流动相B，将脾氨肽内的游离氨基酸、核苷酸从色谱柱上洗脱下来；13-13.5min，流动相组分内包括88.8％的流动相A和11.2％的流动相B，将脾氨肽内的核苷酸和糖从色谱柱上洗脱下来。通过梯度洗脱的方式，陆续从各组分分离出来，由于脾氨肽内成分复杂，色谱分离技术在分离纯化脾氨肽内的多肽时，很难将多肽与脾氨肽内的其他组分如糖、核苷酸等物质彻底分离。因此，本申请在流动相中加入环已醚，环已醚加入流动相B中，在梯度洗脱过程中能明显改善出峰趋势，在步骤三的色谱条件下，使脾氨肽内的多肽集中在出峰时间为16.060-16.462min、23.072-24.022min、29.968-31.451min的色谱峰，能够将脾氨肽内的多肽从脾氨肽内分离出来，达到了分离纯化脾氨肽内多肽的效果。

本发明的进一步设置为：还包括步骤四，冷冻干燥，对步骤三得到的样品冷冻干燥处理，得到冻干粉。