[发明专利]免疫球蛋白GN-糖基的分析方法

说明书

本发明提供一种免疫球蛋白G N‑糖基高通量定量、定性分析技术。该技术利用亲水色谱技术提取免疫球蛋白G，利用96孔板对免疫球蛋白糖基进行酶切、标记，利用超高压液相色谱仪对糖基进行检测，利用R软件对糖基数据进行预处理，利用数据库对糖基结构进行鉴定，最终实现糖基的高通量检测以及糖基数据的定量、定性处理。该方法可应用于抗体糖基检测以及生物标志物筛选，并为将来的研究方向提供参考或指引作用。

技术领域

本发明涉及一种免疫球蛋白G N-糖基高通量定量、定性分析技术的领域，更具体的是涉及抗体糖基检测以及生物标志物筛选的领域。

背景技术

糖基(Glycan)是由单糖通过糖苷键连接形成的完整的糖基结构，N-连接糖基(N-Glycan) 是在特异性糖基转移酶(Glycosyltransferases)的作用下，催化单糖从供体转移向糖链，通过氮原子与蛋白质相连接，形成糖苷键，从而形成N-糖基结构。除N-糖基之外，还有通过氧原子与蛋白质相连的糖基(O-连接糖基，O-Glycan)。虽然糖基具有无数种结构形式，但生物体内N-连接的糖基均含有五糖核心结构(3个甘露糖和2个N乙酰葡萄糖胺)，而O-连接的糖基有多种形式，不存在共有的核心结构。

糖基化(Glycosylation)是在酶的控制下，在蛋白质或脂质附加上糖类的过程，该过程一般发生在细胞的内质网和高尔基复合体上，N-连接的糖基化(N-linkedGlycosylation)合成起始于内质网，完成于高尔基体，O-连接糖基化(O-linkedGlycosylation)在高尔基体中进行。蛋白质经过糖基化作用，形成糖蛋白。糖基化是对蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质功能作用。

血浆N-糖基水平受基因、体内酶系、高尔基体PH值等多种因素影响，基因虽然不能直接引导糖链的合成，但是基因引导糖基转移酶和糖苷酶的合成，因此，寻找到与糖基相关的基因在筛选疾病易感人群及糖基学改变上具有重要意义。环境因素会影响人体内环境状态，从而影响糖基水平或糖基结构。其中包括：饮食模式、碳水化合物摄入、社会经济学因素、吸烟、饮酒情况等。有研究显示，是否吸烟以及吸烟的年数都会影响血浆糖基组水平。同时，社会经济状态与GP4和GP6存在关联，随着社会经济地位的提高，血浆糖基组GP4、GP6 水平会呈现下降趋势。目前也有学者关注于饮食对肠道糖基化水平的影响，推测日常饮食结构会影响机体糖苷含量从而改变免疫状态。

糖基化是最普遍、最复杂的蛋白质翻译后修饰，超过半数的所有蛋白，几乎所有的膜蛋白和分泌蛋白都具有糖基结构。糖基化修饰为非模版驱动，所以糖基结构远远比基因和蛋白质结构复杂，因此也造成了糖基组学研究落后于基因组学和蛋白组学研究。糖基化修饰给蛋白质或脂质带来复杂结构的同时，也影响着细胞的表型特征、代谢状态以及细胞生长周期。 N-连接糖基化参与细胞的分化、生长、细胞转移、细胞间粘附等等生理过程，在分子与细胞、细胞与细胞的相互作用中起到重要的信号识别、介导作用。糖基对蛋白质分子构象的维持、细胞内转运、体内的稳定性和活性方面据具有重要作用。在免疫系统中，糖基参与构成细胞表面抗原、介导免疫反应等生物学功能。信号转导中，糖基参与细胞间识别。因此，在炎症、自身免疫性疾病、衰老、癌症过程中，均有糖类物质的介导，糖基在疾病标志物的筛选方面具有广阔的发展前景：

1.肿瘤标志物的应用

在不同类型的肿瘤患者的肿瘤组织、血清中均发现与肿瘤的发生、发展有显著关联的糖基修饰改变、或者糖基化水平改变。凝集素相关糖蛋白与乳腺癌、结直肠癌存在关联。肝纤维化、肝硬化以及肝癌的病理过程均与蛋白质糖基化修饰的改变有关。

2.在炎症相关疾病的应用

大多数急性期蛋白是糖蛋白，这些蛋白血清水平的改变以及蛋白所连接的糖基改变导致慢性炎症。风湿性关节炎与很多血清糖蛋白以及急性期蛋白的糖基化修饰改变有显著关联。

3.慢性非传染性疾病中应用