[发明专利]一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片及其制备方法和检测方法

权利要求书

1.一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片，其特征在于，包括设有微流控通道的上层基片以及与该上层基片封合的下层基片，所述上层基片设置依次连通的样本处理及DNA提取区、流体控制区以及可视化检测区；其中，所述可视化检测区包括检测池，所述检测池设有包被特异性引物或DNA的色谱纸；所述流体控制区设置进行流体控制的螺丝阀。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述可视化检测区的流体通道包括第一通道、第二通道、第三通道和第四通道；其中，所述第一通道的一端为连接流体控制区和反应试剂入口，所述第一通道的另一端连接第二通道的中部；所述第二通道的两端各自连接用于将流体分配至相对应的检测池的第三通道，在所述检测池入口处的部分第三通道为波浪形通道；所述第四通道用于连接检测池和微池废液出口。

3.一种如权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1)采用光刻胶制作微流控芯片阳模；

步骤2)将铸模溶液浇在步骤1)制得的微流控芯片阳模上，待铸模溶液固化后脱模获得具有微流控通道结构的上层基片；

步骤3)等离子机清洗由步骤2)获得的的上层基片以及下层基片，将包被特异型引物或DNA的色谱纸分别置于各检测池，然后将上层基片与下层基片进行封合，制备成可检测病原体核酸的微流控芯片。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，将螺丝阀预先包埋于未固化的铸模溶液中，所述螺丝阀的底部与微流控通道的垂直距离为0.3～0.8mm；在铸模溶液固化后，将螺丝阀旋转取出，形成具有螺纹的通道，以实现流体控制。

5.根据权利要求4所述的的制备方法，其特征在于，所述螺丝阀的直径为3～8mm，高为3～8mm，螺距为0.5～1.0mm。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述光刻胶为AZ-50光刻胶，所述铸模溶液为PDMS溶液，所述下层基片为玻璃片，所述螺丝阀的材质为PMMA。

7.根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于，所述色谱纸包被的引物包括肺炎支原体等温扩增引物和肺炎链球菌等温扩增引物，所述肺炎支原体等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示，所述肺炎链球菌等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：10所示。

8.一种采用权利要求1所述的微流控芯片用于病原体核酸的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤A)样本的处理：采集咽拭子样本，经无菌生理盐水中经生理盐稀释、离心后获得沉淀物，将所述沉淀物与裂解液和磁珠混匀，获得混合液；

步骤B)病原体核酸的提取：将步骤A)获得的混合液从样品入口处加入到微流控芯片的样品处理及DNA提取区，封堵样品入口及样品废液出口，关闭螺丝阀；微流控芯片置热板上于一定温度下加热一段时间；开启样品入口及样品废液出口，通过磁珠法在微流控芯片上提取DNA；

步骤C)病原体核酸的检测：将去离子水加入到样品处理区后封堵样品入口及样品废液出口，微流控芯片置热板上于一定温度下加热一段时间，旋开螺丝阀；DNA样本在热气压作用下平均分配至各个检测池，所述检测池中设有包被特异性引物或DNA的色谱纸；关闭螺丝阀，从反应试剂入口加入LAMP反应液，然后再加入矿物油，封堵反应试剂入口及微池废液出口；将微流控芯片置于热板于一定反应温度下加热一段反应时间，记录检测结果。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述色谱纸包被的引物包括肺炎支原体等温扩增引物和肺炎链球菌等温扩增引物，所述肺炎支原体等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示，所述肺炎链球菌等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：10所示；所述LAMP反应液包括肺炎支原体等温扩增引物或肺炎链球菌等温扩增引物、反应缓冲液(RM)、钙黄绿素、Bst DNA以及去离子水。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤B)中，通过磁珠法在微流控芯片上提取DNA的步骤包括：

a)将磁柱置于样品处理及DNA提取区的上方，吸附磁珠，移液器除去废液；

b)移开磁柱，移液器吸取无水乙醇反复洗涤磁珠，再将磁柱置于样品处理及DNA提取区的上方，移液器除去废液；

c)移开磁柱，移液器吸取75％乙醇反复洗涤磁珠，再将将磁柱置于样品处理及DNA提取区的上方，移液器除去废液。