[发明专利]从头合成维生素B12

说明书

本发明提供了一种从头合成维生素B₁₂的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。具体地，本发明以大肠杆菌为出发菌株，构建了包含HBA基因模块、HBAD基因模块、CBAD基因模块和Cbi基因模块的工程菌，所述工程菌不仅高效快速生产B₁₂(产率高出现有技术至少50倍)，甚至可以以简单化合物的原料，从头合成维生素B₁₂。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及从头合成维生素B₁₂的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用

背景技术

维生素B₁₂又称氰基钴胺素，是工业生产应用的一种稳定的钴胺素形式。钴胺素主要包括腺苷钴胺素(脱氧腺苷钴胺素)、甲基钴胺素、羟基钴胺素和氰基钴胺素。腺苷钴胺素的化学结构包括一个中心钴啉环、上配体(腺苷基团)和下配体(5,6-dimethylbenzimidazole，DMBI)。

限于化学合成成本极高，维生素B₁₂只能通过微生物发酵来获得。维生素 B₁₂从头合成途径包括好氧途径和厌氧途径两种。目前维生素B₁₂工业生产菌株主要有脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrifican)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌 (Propionibacteriumshermanii)等。

大肠杆菌可以通过补救合成途径合成维生素B₁₂，遗传背景清晰，易于遗传操作，培养方法简单，生长迅速，因此可以替代传统的菌株用于生产维生素B₁₂。关于大肠杆菌合成维生素B₁₂的研究很少。

传统维生素B₁₂生产菌株生长周期长，例如，中华苜蓿根瘤菌和脱氮假单胞菌发酵周期大约十天；培养基成分复杂，有的培养基中需添加各种维生素，增加了生产成本；有的生产菌株，例如，费氏丙酸杆菌，发酵培养时会生成大量丙酸，维生素B₁₂得率低。好氧合成途径合成维生素B₁₂中部分反应是未知的。而已报道在大肠杆菌中通过好氧合成途径合成维生素B₁₂的先例都没有通过严谨的方法对维生素B₁₂做鉴定，而是通过营养缺陷型菌株检测维生素B₁₂。这种检测方法会产生假阳性。同时，现有技术中利用大肠杆菌合成维生素B₁₂的产量都不高，不能满足工业生产的需求。因此，本领域迫切需要开发适用于工业生产的从头合成维生素B₁₂的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

发明内容

本发明的目的在于提供从头合成维生素B12的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

在本发明的第一方面，提供了一种用于生产维生素B₁₂或其前体的工程菌，所述工程菌为大肠杆菌，并且所述工程菌含有外源的基因模块(gene module)，所述的基因模块包括：

(a)HBA基因模块，所述HBA基因模块表达用于生物合成HBA的基因；

较佳地，所述的用于生物合成HBA的基因包括：cobA、cobI、cobG、cobJ、 cobM、cobF、cobK、cobL、cobH。

(b)HBAD基因模块，所述HBAD基因模块表达用于以HBA为原料，生物合成 HBAD的基因；

较佳地，所述的用于生物合成HBAD的基因包括：cobB基因；

(c)CBAD基因模块，所述CBAD基因模块表达用于以HBAD为原料，生物合成 CBAD的基因；