[发明专利]一种荧光互补检测人趋化因子生物学活性的方法

说明书

本发明公开了一种利用荧光互补检测人趋化因子生物学活性的方法。一种用于检测人趋化因子的生物学活性的融合蛋白组合，包括蛋白CXCR2‑VC和蛋白β‑Arrestin2‑VN，蛋白CXCR2‑VC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白β‑Arrestin2‑VN的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过优化黄色荧光蛋白Venus的拆分位点和linker序列的选择，成功的构建了用于检测人趋化因子的生物学活性的融合蛋白组合。通过两个重组载体分别转化，克服了两个重组载体共转化本底荧光较强无法达到检测目的的问题。本发明构建的融合蛋白组进行趋化因子的活性检测，简单易行，步骤简单，检测效果好，结果可靠。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种荧光互补检测人趋化因子生物学活性的方法。

背景技术

趋化因子是由多种细胞分泌的分子量在8-14kDa的可溶性蛋白，目前报道的趋化因子家族有48个成员，根据其蛋白氨基酸序列N端的色氨酸保守性可以分为C、CC、CXC、CX3C四类。趋化因子受体是G蛋白偶联受体(GPCR)，趋化因子与其受体结合后，可以激活腺苷酸环化酶、磷脂酶C等经典的GPCR信号通路，调控cAMP、Ca2+水平，还可激活MAPK、PI3K及一些酪氨酸激酶信号通路，在免疫趋化、血管再生、创伤愈合、自身免疫、肿瘤发生等过程中起着重要的作用。现有的检测趋化因子生物学活性的方法，要检测细胞的趋化能力，一般需要用到Transwell小室，细胞受到梯度趋化因子刺激后穿过小室滤膜，黏附在膜的下面，染色并计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力，趋化活性常用的表示方法是趋化指数(chemotactic index，是指细胞迁移到待测样品液的数目和迁移到对照液的数目的比值)，由于细胞类型不同，趋化因子需要调整浓度来获得比较好的趋向性，过程十分复杂。

荧光蛋白互补(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)主要是将一种荧光蛋白在合适氨基酸位点拆分为两部分，把拆分后的蛋白分别与要研究的两种目的蛋白融合，若目的蛋白能够相互结合，会拉近两个拆分的荧光蛋白并使得荧光蛋白结构恢复成拆分前状态，进而通过不同波长光激发，通过荧光显微镜检测相对应的荧光，方法直观。这种技术已在有多种应用，但是用于检测趋化因子生物学活性的还鲜有报道。

CXCR2是GPCR受体家族的重要成员，它的配体趋化因子是CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8，这些趋化因子与CXCR2结合后会使CXCR2与β-Arrestin2蛋白结合，并激活下游的信号通路。CXCR2在癌症的发生、发展过程中扮演着重要的角色，在患癌病人中的表达明显提高，越来越多的研究表明CXCR2是治疗癌症的重要靶标，如在横纹肌肉瘤疾病模型中，抑制CXCR2引导的骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derivedsuppressor cells，MDSCs)的迁移可以提高PD-1抗体治疗肿瘤的效果。抑制CXCR2的功能还可以抑制急性和慢性胰腺炎(RJ，Sansom OJ，Morton JP，2015)等，抑制IL8-CXCR2信号通路能使白血病细胞系及骨髓增生细胞停滞在G0/G1期而对正常的造血干细胞没有影响(Schinke C，Giricz O，2015)，由于CXCR2在疾病发生中的重要作用，CXCR2是治疗疾病的重要靶点，开发CXCR2抑制剂具有潜在的科研及应用价值，如SB225002是第一个被发现的CXCR2小分子抑制剂并被进一步改造为SB265610和SB656933，Ha H等人用CXCR2配体相关的药效模型进行筛选了一批CXCR2的抑制剂(Ha H，Debnath B，2015)，但是这种方法需要检测钙信号、细胞增殖等，方法步骤上比较多，不是特别简单和直观。

利用BiFC技术检测趋化因子的生物学活性，将拆分的荧光蛋白片段与CXCR2、β-Arrestin2连接，在趋化因子存在下，CXCR2、β-Arrestin2空间上结合，促使拆分的荧光片段互补形成完整的荧光蛋白，可用荧光检测，方法简单。同时构建的细胞系还可用于CXCR2相关药物研究，有很好的科研、商业价值。

发明内容