[发明专利]用于抑制梨果实采后青霉病的制剂GS115/Ac-AMP2

说明书

本发明公开了一种用于抑制梨果实采后青霉病的制剂GS115/Ac‑AMP2，为导入Ac‑AMP2抗菌肽之后的重组酵母GS115/Ac‑AMP2。重组酵母GS115/Ac‑AMP2的构建方法为包括以下步骤：将优化后的Ac‑AMP2基因通过Xho I和Not I双酶切以及T4连接酶构建到pPICZαA载体上，将形成的pPICZαA/Ac‑AMP2重组表达载体线性化酶切后，电转化GS115感受态细胞中，在含有Zeocin抗性平板中挑取单菌落PCR和测序验证，得到重组毕赤酵母GS115/Ac‑AMP2菌株。本发明能用于抑制果实采后病害的保鲜。

技术领域

本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种在毕赤酵母GS115中转化和过表达Ac-AMP2抗菌肽提高其对果实病害的防治技术。

背景技术

现阶段主要采用化学杀菌剂的方法来防治果蔬菜后病害，然而过度使用化学杀菌剂会危害人体健康、造成环境污染以及产生抗药性等问题。当前，欧盟已禁止化学杀菌剂在核果类果实中的应用，因此寻找安全无毒、环境友好和高效抑菌的化学杀菌剂替代品成为现阶段迫切需求。

将拮抗微生物用于果实采后病害的生物防治被视为最有可能替代化学杀菌剂的方法之一，拮抗酵母具有安全无毒、使用方便以及遗传稳定等优点使其商品化运用成为可能。但目前拮抗微生物的生物防治效果仍无法达到或接近化学杀菌剂，因此为进一步提高拮抗酵母的生防效果，研究者们进行了多种尝试，包括逆境胁迫处理、培养条件优化、逆境条件分离拮抗菌种以及表达外源基因等，其中随着分子技术的高速发展，将表达产物具有直接抑菌效力以及能提高拮抗微生物抗逆性等外源基因定向转化拮抗酵母逐渐成为生物防治领域的研究热点。毕赤酵母具有遗传操作简单、外源基因表达水平高且稳定、表达产物可加工及修饰等特点受到研究者青睐，目前已有多种抗菌肽在毕赤酵母中成功表达。

抗菌肽作为一种生物体特定基因编码产生的一类小分子多肽，对细菌具有高效光谱的杀灭能力，同时对病原真菌、病毒、原虫等也具有较强抑制作用。

Ac-AMP2抗菌肽来自于尾穗苋(Amaranthus caudatus)种子，且具有强的热稳定性和PH稳定性，沸水浴10min以及PH在2～11之间仍具有活性；同时对病原真菌抑制效果显著，其中对链格孢菌(Alternaria brassicola)的半抑制浓度(IC₅₀)低至4μg/mL，对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的半抑制浓度(IC₅₀)低至8μg/mL。对人脐血管内皮细胞和人体皮肤肌肉纤维细胞不具有毒害作用。

Ac-AMP2抗菌肽目的基因(即，原始的Ac-AMP2基因)在Antimicrobial peptidesfrom Amaranthus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine/glycine-rich domain of chitin-binding proteins中被公开，其序列为：

ATGGTGAACATGAAGAGTGTTGCATTGATAGTTATAGTTATGATGGCGTTTATGATGGTGGATCCATCAATGGGAGTGGGAGAATGTGTGAGAGGACGTTGCCCAAGTGGGATGTGTTGCAGTCAGTTTGGGTACTGTGGTAAAGGCCCAAAGTACTGTGGCCGTGCCAGTACTACTGTGGATCACCAAGCTGATGTTGCTGCCACCAAAACTGCCAAGAATCCTACCGATGCTAAACTTGCTGGTGCTGGTAGTCCA。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种不借助化学杀菌剂的前提下，利用导入Ac-AMP2抗菌肽基因后的重组毕赤酵母GS115/Ac-AMP2抑制果实采后病害的保鲜技术。