[发明专利]一种基于原子力显微镜的红细胞力学特征的检测方法

说明书

本发明提供了一种基于原子力显微镜的红细胞力学特征的检测方法，涉及生物物理学技术领域。本发明采取的技术方案是使用细胞爬片固定红细胞，具体步骤为：红细胞悬液制备、细胞爬片预处理、原子力显微镜样品制备、使用原子力显微镜在液态环境下检测红细胞力学特征。用细胞爬片固定红细胞，可保持红细胞仍然处于生理状态，对红细胞的正常形态和功能的维持作用是非常明显的。常规使用的细胞爬片经过必要的消毒和无害化处理，对红细胞没有附加的药物影响和毒害，不会影响细胞的形态和功能。经过细胞爬片处理的红细胞，既能保证红细胞稳定地附着住，又能单一检测出红细胞的力学特征而不会有其他影响和干扰，能够反映细胞真实的生理特征。

技术领域

本发明涉及生物物理学技术领域，具体涉及一种红细胞力学特征的检测方法。

背景技术

上世纪八十年代出现的原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)可以在液体环境下，以极高的灵敏度和分辨率对活体细胞进行表面形貌成像及力学性质检测，细胞的力学特性包括弹性、黏度和硬度等。通过细胞弹性，硬度的改变，可推知细胞在生理病理过程中的变化。生物细胞力学的研究与诸多生物学过程密切相关，机体的器官、组织、细胞和生物大分子在一定范围力学作用下发生相应的形态和功能改变，这是机体对力学刺激的响应过程，而机体对一定范围力学刺激的自适应，对于维持正常生理功能具有重要作用。原子力显微镜有一个重要的特点，即利用其非修饰和修饰探针进行样品扫描，可以得到样品表面形貌，并获得样品表面某一特定点的力与距离的关系曲线，进而得到黏附力、键合力等数据以及样品的机械性质。

原子力显微镜的优缺点：与传统显微技术相比，AFM具有以下优点：1.可达到原子级高分辨率。无论是横向还是纵向的高分辨率都可以在普通的商用机上获得。2.可得到高分辨的物体表面三维形貌，获得样品表面形貌、弹性、粘性、力学、电学、磁学等多种信息。3.可以在多种环境(如真空、气体、溶液、电化学环境等)下工作，能在接近生理状态的条件下观察样品，从而避免制样过程中所造成的样品变形或变性。4.无需对样品进行包埋、覆盖、染色，制样简单，对样品无侵入性、破坏性，可以探测柔软的样品表面的结构信息。5.样品可以是金属、半金属、半导体及绝缘体，基底可以是云母、玻璃片、硅片、高取向热解石墨、金等。6.AFM通过调节成像操作力的大小，选择合适的成像模式，不易引起样品漂移、损坏，图像可重复性高。AFM在生命科学研究中尽管有着极大的优越性，但同时也存在以下缺点：1.针尖的曲率半径及形状对图像的影响。只有针尖比扫描对象更尖锐，才能将扫描对象的边界真实呈现出来；当扫描对象比针尖更尖锐时，图像将会发生失真。2.不可获得样品的内部结构。AFM能够获取比其它显微技术更多的表面信息，但无法像透射电镜(TransmissionElectron Microscopic，TEM)或近场光学显微镜那样观察细胞的内部结构。3.对扫描样品的识别问题。AFM只能得到样品表面的形貌图，却不能识别样品表面的物质，所以AFM适合扫描单一的物质，对于混合物AFM很难直接从形貌上把它们区分开来。4.扫描速率的问题。目前商用AFM得到一幅高分辨的图像需要几分钟到数十分钟。很多生化反应是瞬时完成的，还不能用AFM观测。5.由于施加给AFM悬臂的力的精确度受到外部因素如热漂移等的影响，只能人为地通过平滑等将这种漂移抵消。

针对正常人成熟红细胞而言，使用原子力显微镜技术检测其生理状态下的力学特征，目前的技术常常会带来许多问题和对红细胞结构和功能的影响，不能反映红细胞真实的、生理状态下的力学指标。例如，常规方法为使用1％戊二醛固定法固定红细胞，需要对固定样品进行干燥，在气态条件下对红细胞进行原子力显微镜检测力学特征。这样的处理方式带来了对红细胞最重要的影响是：干燥处理使原本处于生理状态下的红细胞失去了正常的生物学特征、性状和功能，以此条件检测得出的结果，不能反映真实的红细胞形态和功能。其次，戊二醛作为一种化学物质，无论使用多小的剂量，对细胞生物学特征或功能或多或少都会有影响，对实验结果造成的影响也是不可回避的。最后，戊二醛固定的处理方法，可使待检测的样品表面的粘滞度增大，造成原子力显微镜探针受到粘滞力作用而无法正常工作。

发明内容