[发明专利]一种人工诱导雌核发育金鱼的头形性状纯种系培育方法

权利要求书

1.一种人工诱导雌核发育金鱼的头形性状纯种系培育方法，其特征在于：

1）人工排精

采用青灰色性腺成熟雄性鲤鱼作为亲鱼，先按每尾注射2 ～3 μg促黄体生成激素释放激素，再以每kg鱼重注射500 ～800 U人绒毛膜促性腺激素促排精, 10 h后采集精液，使用以60～80倍数的Hank's液对采集精液进行稀释，得到精子稀释液；

2）精子灭活

利用常压室温等离子体的育种仪分批次对精子稀释液进行精子失活处理，得到失活精子液，合并后于-2～4℃低温避光保存备用保存；合并前每20μL失活精子液中加入5μL 0.6M甘露醇、10μL Hank's 液；

3）干法受精

准备一只经消毒的瓷盆，用干的软毛巾擦干具有目标头形性状的雌性金鱼鱼体表面，用大拇指和食指由胸鳍向臀鳍方向轻挤腹部，使鱼卵排入瓷盆中，一边倒入失活精子液，一边用干净的毛笔在失活精子液中轻轻搅动，使精子和卵子充分接触，2～3min 后将受精卵均匀铺洒在孵化缸的鱼巢上；

4）雌核发育二倍体化

在孵化缸中将细胞松弛素B溶液降温至 0～4℃温度，将鱼巢上受精卵在细胞松弛素B溶液中持续浸泡20-30分钟，之后放回23-26℃水温的孵化池进行自然孵化；

5）雌核发育二倍体化的金鱼个体筛选：

经过判定雌核发育已经达到二倍体化后，继续孵化培养, 经过50～100天孵化培养，体色转变，弃去青灰色的金鱼苗个体；

6）建立目标头形性状的F1代金鱼

将金鱼苗个体移入育苗池中进一步培育, 期间不断剔除掉非目标头形性状雌核发育的金鱼苗，保留目标头形性状鱼苗个体,继续培育到2～4龄，得到目标头形性状的F1代金鱼；

7）目标头形性状F2代金鱼纯种系的培育

以F1代雌性金鱼、体色为青灰色的雄性鲤鱼为亲鱼，重复1）-5）的步骤，得到目标头形性状的F2代金鱼纯种系。

2.根据权利要求1所述的一种人工诱导雌核发育金鱼的头形性状纯种系培育方法，其特征在于所述的精子失活处理，其条件为:精子稀释液上样量20μL，处理输出功率125 W，气体流速10 L·min^{－ 1}，辐照距离2 mm，处理时间为20～60 s。

3.根据权利要求1所述的一种人工诱导雌核发育金鱼的头形性状纯种系培育方法，其特征在于所述的判定，其方法为：自然孵化过程金鱼卵发育至原肠晚期时, 取50个以上的胚胎, 用0.75% NaCl清洗一次, 去卵膜后置于5 ml刻度离心管中, 吸打成细胞悬液, 加入终浓度达0.5～1μg/ml的秋水仙碱，处理1～3小时后按常规方法制片、染色，检查染色体二倍化率达到95%。

4.根据权利要求1所述的一种人工诱导雌核发育金鱼的头形性状纯种系培育方法，其特征在于所述的细胞松弛素B溶液，其浓度为40～60ppm。