[发明专利]一种罗非鱼无乳链球菌蜂胶灭活疫苗及规模化制备技术

说明书

技术领域

本发明属水产养殖病害免疫防治技术领域，具体涉及一种罗非鱼无乳链球菌蜂胶灭活疫苗及规模化化制备技术。

背景技术

我国是罗非鱼养殖及出口大国，近年来养殖的罗非鱼无乳链球菌病发生率呈上升趋势，在华南地区罗非鱼主养区域呈暴发性流行态势，池塘养殖和网箱养殖的罗非鱼均可发病，发病率在20％～60％，死亡率最高可达90％以上。现有技术中的罗非鱼无乳链球菌病主要依靠抗生素及化学药物进行控制，具有一定的治疗作用，但是药物使用量大，养殖成本较高的同时还制约着水产养殖业的发展。因而研究安全高效控制水生经济动物主要病害的疫苗免疫防制措施应作为今后的主要研究方向之一。蜂胶是黄酮类化合物的宝库，从而具有多方面的天然药物特性，蜂胶中还含有醇、酚、醛、酸、醚类以及烯、烃、萜、甾类化合物和多种氨基酸、脂肪酸、酶、多种维生素和微量元素等生物活性物质，蜂胶虽不具有抗原特性，但具有免疫增强作用，能提高抗体产生能力，提高血清蛋白和球蛋白含量，提高白细胞和巨噬细胞吞噬能力，蜂胶的免疫增强功能表现为免疫防御、免疫自稳、免疫监视三个方面，可增强机体免疫反应、激活与保护免疫器官，是优良的免疫佐剂，对机体免疫系统具有广泛的作用。我国水产疫苗研究与开发起步较晚，在水产疫苗的开发应用上同先进发达国家有较大差距，至今还无产业化罗非鱼链球菌疫苗产品在生产实际中使用，疫苗规模化制备方法缺少，基本为实验室制备技术。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供了一种罗非鱼无乳链球菌蜂胶灭活疫苗及规模化制备技术。

本发明通过如下的技术方案来实现：一种罗非鱼无乳链球菌蜂胶灭活疫苗，所述疫苗包括以下组分：灭活无乳链球菌浓缩液、生理盐水和蜂胶佐剂。

优选的，所述灭活无乳链球菌浓缩液的细菌浓度高于30×10⁸cfu/ml。

本发明还提供了一种罗非鱼无乳链球菌蜂胶灭活疫苗的规模化制备技术，该技术包括如下步骤：灭活无乳链球菌浓缩液使用生理盐水稀释，然后与蜂胶佐剂，混合搅拌均匀，无菌灌装，即得到疫苗成品。

优选的，所述罗非鱼无乳链球菌蜂胶灭活疫苗的规模化制备技术具体包括如下步骤：将灭活无乳链球菌浓缩液以无菌生理盐水稀释，加入配苗罐，搅拌速度50-100r/min，边搅拌边加入10％体积的蜂胶溶液，搅拌混合30min后，在无菌条件下，灌装制得疫苗成品。

优选的，所述灭活无乳链球菌浓缩液的制备包括如下的步骤：

(1)无乳链球菌一级种子制备；

(2)无乳链球菌二级种子制备；

(3)无乳链球菌发酵液发酵；

(4)无乳链球菌发酵液灭活；

(5)灭活无乳链球菌液离心、浓缩。

优选的，所述无乳链球菌一级种子制备包括如下步骤：无乳链球菌接种脑心浸液琼脂，37℃条件下培养24小时，挑菌苔接种300ml脑心浸液培养基，在37℃，180r/min条件下，培养24小时，得到一级种子液。

优选的，所述无乳链球菌二级种子制备包括如下步骤：一级种子液,接种30L发酵培养基，在37℃条件下通气搅拌培养12h，得到二级种子。

优选的，所述无乳链球菌发酵液发酵，包括如下步骤：二级种子接种300L发酵培养基，37℃，200r/min，通气量250L/min培养，培养12-14小时，取样，测定菌液A600值，直到菌液A600开始下降，停止发酵。

优选的，所述无乳链球菌发酵液灭活包括如下步骤：将无乳链球菌发酵菌液转入灭活罐，添加终浓度0.40％甲醛，37℃，50-100r/min灭活24小时。

优选的，所述灭活无乳链球菌液离心、浓缩包括如下步骤：灭活无乳链球菌液利用管式离心机离心收集菌体，用灭菌生理盐水重悬制成灭活无乳链球菌浓缩液。

本发明中的罗非鱼无乳链球菌蜂胶灭活疫苗工厂化制备技术，可规模化生产，降低疫苗制备成本。疫苗可通过注射方式施用，免疫养殖罗非鱼，免疫效果良好，可有效预防无乳链球菌引起的出血病等，减少病害损失。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例

实施例提供了一种罗非鱼无乳链球菌蜂胶灭活疫苗模化生产技术，具体包括如下步骤：

(1)一级种子制备：无乳链球菌接种脑心浸液琼脂，37℃，培养24小时，挑菌苔接种9瓶300ml脑心浸液/瓶，37℃，180r/min，培养24小时，得到2.7L摇瓶种子液；