[发明专利]用于合成大黄素的工程改造的宿主细胞和方法

权利要求书

1.一种用于合成大黄素的工程改造的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含以下核酸组合：

EmoA和ACTE1；

或者包含EmoA、ACTE1和ACC1；

或者包含EmoA、ACTE1和TpcK；

或者包含EmoA、ACTE1和HYP3；

或者包含EmoA、ACTE1、ACC1和TpcK；

或者包含EmoA、ACTE1、ACC1和HYP3。

2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为细菌细胞或酵母细胞。

3.根据权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于：所述细菌细胞为大肠杆菌。

4.根据权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于：所述酵母细胞为酿酒酵母或毕赤酵母。

5.一种利用权利要求1-4任一所述的宿主细胞合成大黄素的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）构建及培养宿主细胞，其中所述宿主细胞用EmoA和ACTE1；或者用EmoA、ACTE1和ACC1；或者用EmoA、ACTE1和TpcK；或者用EmoA、ACTE1和HYP3；或者用EmoA、ACTE1、ACC1和TpcK；或者用EmoA、ACTE1、ACC1和 HYP3转化，并诱导所述工程改造的宿主细胞进行上述任意一组核酸组合的表达；

（2）对大黄素进行收集和分离纯化。

6.根据权利要求5所述的合成大黄素的方法，其特征在于：所述宿主细胞为酵母细胞，所述酵母细胞的培养方法包括以下步骤：

A1. 培养所构建的工程菌酵母，先在含有6.7 g/L酵母氮源、20 g/L葡萄糖的酵母SC缺陷培养基中培养，并添加省却成分氨基酸混合物；30℃，250 rpm下培养直至OD600达到0.6；

A2. 转移至含有YPD培养基中，根据培养效果调整培养温度、振荡频率和培养时间根；

A3. 通过A2步骤培养所得的工程菌酵母在SC培养基中培养，并滴加相应的缺少成分，30℃，250 rpm，直至OD600达到1.0，添加入1%酵母提取物和2%蛋白胨，28℃，250 rpm下持续发酵6~8天，得发酵液；

A4. 发酵液通过3500 rpm离心4-6分钟，收集细胞体，细胞体采用有机物提取，并于离心所得上清液，混合后蒸发浓缩，随后进行分析。

7.根据权利要求6所述的合成大黄素的方法，其特征在于：

所述添加省却成分氨基酸混合物的步骤具体为：含有1个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.77 g/L-Ura DO supplement；含有2个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.72 g/L-Trp/-Ura DO supplement；含有3个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.62 g/L-Trp/-Ura/-Leu DO supplement；含有4个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.60 g/L-Trp/-Ura/-Leu/-His DO supplement。

8.权利要求1所述宿主细胞在生产大黄素中的应用。

9.一种用于扩增EmoA的PCR引物，其特征在于：所述EmoA扩增的正向引物基因序列如SEQ ID No.1 所示，EmoA的反向引物基因序列如SEQ ID No.2 所示。

10.一种用于扩增ACTE1的PCR引物，其特征在于：所述ACTE1扩增的正向引物基因序列如SEQ ID No.3 所示，ACTE1的反向引物基因序列如SEQ ID No.4 所示。