[发明专利]一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基

说明书

本发明公开一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基，该优化培养基包括DMEM培养基、F‑12Nutirient Mix培养基、0.5mg/ml的氢化可的松、胎牛血清、25ug/ml的表皮生长因子、5mg/ml的胰岛素、11.7uM的霍乱毒素、10mM的ROCK1抑制剂、10mM的BMP4拮抗剂。本发明利用优化的培养基培养人气道上皮细胞的方法，不仅大大的简化了需要3T3 J2细胞为饲养层而培养上皮细胞的步骤，只需要将链霉蛋白酶消化的原代人气道上皮细胞培养于本发明优化的培养基中，且获得了快速分离且无限传代培养的人气道上皮细胞，将传代培养的人气道上皮细胞进行体外扩增培养，达到20代以上，即可获得足够量的种子细胞用于如体外细胞互作模型研究等诸多后续的体内外研究中。

技术领域：

本发明属于原代细胞分离培养技术领域，具体涉及一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基。

背景技术：

人的气道主要是由基底细胞、杯状细胞、纤毛细胞等三种上皮细胞组成的假复层上皮，其中基地细胞排列在基底膜，是目前公认认的气道上皮干细胞，杯状细胞产生粘液以捕获吸入的颗粒和病原体，而纤毛细胞产生运动力将其从肺部移除。气管移植后，粘液纤毛清除受损是一个重要的挑战，因为分泌物保留在远端吻合部位。气道上皮细胞的体外培养增殖是气道上皮功能和再生医学研究的基础，但目前细胞的分离方法和培养条件都无法满足实际研究需求，而从支气管内活检获得且在无血清支气管上皮生长培养基(BEGM)中培养而获得足够数量的自体上皮细胞存在很大的挑战。这是扩增基地细胞进行体外研究的有用工具，但是我们发现它不适合上皮细胞生物学和组织再生工程的研究，因为培养失败，生长的细胞不能提供足够的细胞数量用于移植物覆盖。另外，在BEGM中，通过在一次或两次传代后，自我更新能力开始在培养物中丧失。因此，用BEGM培养人气道上皮细胞不能过获得足够数量的用于组织工程气管移植。

目前，有研究通过与有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞共培养，实现人体表皮干细胞的体外长期扩增，即Rho相关蛋白激酶(ROCK)的抑制增加增殖并有条件地使细胞永生化，从而允许干细胞的无限繁殖以及组织适当的分化能力。但其操作复杂、繁琐，原代细胞培养过程中细胞状态受到丝裂霉素C处理3T3 J2细胞的影响较大。因此，寻求简单且有效的人气道上皮细胞培养的方法与培养基对获得足够量的上皮细胞尤为重要。

发明内容：

本发明的目的旨在提供一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供一种培养人气道上皮细胞的优化培养基。

为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法，包括如下步骤：

1)清洗人支气管或细支气管：取离体的肺脏组织，去除支气管或细胞支气管周围多余的脂肪和结缔组织后，用无菌的剪刀剪成块状于无菌离心管中，在4℃条件下用PBS缓冲液进行旋转漂洗10次，30min/次后，备用；

步骤1)中所述PBS缓冲液为预冷无菌的含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素B的溶液。

2)分离人气道上皮细胞：将清洗好的组织块置于冻存管中，加入预先配置好的消化液，在37℃条件下旋转消化40-60min后，待气管变软后且有细胞团块或单细胞时，将冻存管中的消化液和组织块一起转移至离心管中，加入胎牛血清(FBS)至终浓度为5％，盖上盖子，轻轻上下颠倒20次达到终止消化；

步骤2)中所述预先配置好的消化液是由DMEM培养基、1％双抗、2.5μg/ml两性霉素B和15mg/mL链霉蛋白酶(pronese)配制而成的。

3)收集人气道上皮细胞：将消化好的人气道上皮细胞，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基进行悬浮；