[发明专利]高稳定性的PD-L1抗体试剂及其应用

说明书

本发明高稳定性的PD‑L1抗体试剂，包括有鼠抗人PD‑L1单克隆抗体和抗体稳定剂，抗体稳定剂选自：Peroxidase Stabilizing Buffer，Sigma:P9209(货号P 9209)；鼠抗人PD‑L1单克隆抗体选自：PD‑L1Monoclonal Antibody，Thermo Fisher：14‑5983‑80。本发明提供的高稳定性PD‑L1抗体试剂，通过抗体稳定剂和PD‑L1单克隆抗体的合理配合，得到了可于4℃稳定保存的抗体，储存方便，避免反复冻融导致的抗体效价降低，同时提供的试剂盒对免疫组化检测PD‑L1时所需试剂进行了整合，使PD‑L1的免疫组化检测更直观、更方便快捷。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及了一种PD-L1免疫组化试剂盒。

背景技术

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居肿瘤收尾，且有逐年上升的趋势。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌总数80-85％左右，约75％的患者发现时已处于中晚期，平均生存期12.9个月，3年、5年生存率较低，分别为19％及11％。目前非小细胞肺癌的治疗方式主要包括手术治疗、化疗、放疗及分子靶向治疗。手术治疗仍然是可能治愈患者的唯一治疗方式，然而许多非小细胞肺癌患者发现时往往已经丧失了手术机会。近年来，NSCLC的治疗特别是药物治疗(如分子靶向治疗)取得了一定进展，但治愈患者的5年生存率并未有显著改善，寻找有效的治疗手段迫在眉睫。近年来，肿瘤的免疫治疗成为继分子靶向治疗之后的新热点，随着肿瘤免疫学机制研究的深入，一些免疫治疗方法引入临床，但大多还处于探索阶段，对治疗肿瘤仍有限。因此对肿瘤免疫机制的深入研究，了解肿瘤发生和发展规律，为寻找更有效的治疗方法具有重要意义。

通过对肿瘤免疫耐受和逃逸机制的广泛而深入的研究发现，参与机体免疫调节的协同刺激分子的表达异常在肿瘤的免疫逃逸中扮演着重要角色。其中，程序性死亡因子1(programmed death-1，PD-1)及其配体程序性死亡因子1配体1(programmed deathligand-1，PD-L1)作为CD28/B7协同刺激分子超家族的成员，可以介导负性协同刺激信号，能有效抑制T、B细胞的功能和增殖，同时减少细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌，该抑制途径参与的免疫调节在肿瘤免疫逃逸、肿瘤微环境形成中起到了重要的作用，与肿瘤的发生和发展密切相关。阻断PD-1/PD-L1通路能够抑制肿瘤微环境的形成并且增强内源性的抗肿瘤免疫应答。目前处于临床试验阶段的PD-1/PD-L1抑制剂有很多，2015年3月，PD-1抑制剂nivolumab已经率先被FDA批准并用于治疗在经铂为基础化疗期间或化疗后发生疾病进展的转移性鳞性非小细胞肺癌。有研究显示，肿瘤组织中PD-L1的表达与NSCLC患者接受免疫治疗的有效性相关，也与NSCLC患者的不良预后和高侵袭性密切相关。因此检测NSCLC组织中PD-L1的表达可辅助NSCLC患者用PD-1/PD-L1抑制剂疗效预测。

如何准确、快速的检测出非小细胞肺癌组织中PD-L1蛋白的表达情况是辅助预测PD-1/PD-L1抑制剂疗效的关键因素。目前，检测PD-L1的表达情况主要采用的方法有测序法、实时定量PCR法及组织免疫组化法等方法。这些方法各有优劣，但测序法、实时定量PCR法存在操作复杂、耗时长、成本相对较大、等不足之处，而免疫组化法操作简单、耗时短、成本相对较少有利于检测非小细胞肺癌组织中PD-L1的表达情况。

组织免疫组化的方法，使用到的试剂主要包括与组织中需检测的蛋白特异性结合的一抗、二抗和显色剂。传统试剂中的一抗需在较高浓度时、于-20℃甚至更低温度储存，才能维持较高的稳定性。因此，一般免疫组化实验中使用到的一抗试剂或试剂盒，应在孵育一抗前，将一抗从-20℃取出，待溶解并混合均匀后，使用PBS或类似抗体稀释液将一抗稀释至工作浓度，立即使用。因此，传统的用于免疫组化或其他免疫学实验的一抗试剂存在需于-20℃低温储存，且使用前还需稀释步骤，储存和取用较不方便的问题。同时，于-20℃储存用时需溶解，反复冻融会使抗体稳定性变差，易导致效价下降的问题。