[发明专利]猪PLIN2基因超表达的PK-15细胞株及扩增PCV2病毒的方法

说明书

本发明提供了一株超表达PLIN2的PK‑15细胞株，该细胞的制备方法以及用该细胞产生高效价PCV2病毒的方法。本发明的细胞株对PCV2病毒易感，是制备该病毒的高效率扩增细胞。

发明所属领域

本发明属于细胞工程与病毒培养技术领域，具体地说，本发明涉及一种能大幅度提高猪圆环病毒2型(PCV2)培养效价的重组细胞株，制备方法及培养高效价PCV2病毒方法。

技术背景

目前国内正在使用的猪圆环病毒疫苗主要有2种----亚单位苗和全病毒疫苗，亚单位苗虽安全性较好，但生产成本高昂，免疫期短。因此国内绝大部分猪场仍以全病毒疫苗为主。但全病毒疫苗生产亦有其技术瓶颈：病毒培养效价很难上升到理想状态，为解决该难题，疫苗生产者都在其培养工艺中增加一个用D-氨基葡萄糖处理，使细胞停留于分裂Ⅱ期，保证病毒扩增的程序。但该程序不仅增加了原材料投入，而且增多了生产环节和人力投入，增加了废弃物排放量，使生产成本至少增加1倍以上。即便如此，国内许多厂家生产的圆环病毒疫苗，其病毒效价在10⁴以下，免疫效果较差。欧美国家采取筛选对圆环病毒高度敏感细胞系，培养圆环病毒以及进行病毒浓缩，其病毒含量均在10⁶以上，免疫效果较好，但其生产成本高昂，销售价格往往是国产疫苗的3-5倍。因此如何提高圆环病毒的培养效价而又降低生产成本是国内厂家目前提高圆环病毒疫苗竞争能力的主攻方向。

PLIN即脂滴包被蛋白是分布于脂滴表面的含量最多的围脂滴蛋白。最早在附睾脂肪细胞中发现，是脂肪分解调控中的分子开关。PLIN2基因是PLIN家族中的一员，猪PLIN2基因在体内参与动物或细胞的脂类代谢。但关于该基因对圆环病毒增殖的影响至今尚未见文献报道。

本发明的技术内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种对PCV2病毒易感，且能大幅提高PCV2培养效价的转基因PK-15细胞株。

本发明的再一个目的是提供一种制备PCV2病毒的方法。

本发明的另一个目的是提供扩增的PCV2病毒在制备PCV2疫苗中的应用。

本发明公开了一种超表达猪PLIN2基因的PK-15细胞株，其特征是：PK-15 细胞含有人工转染的外源猪PLIN2基因，且PLIN2基因具有SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列，该细胞对PCV2病毒易感，且能产生效价达到10^-7以上的病毒，该细胞是猪肾PK‐15/PLIN2细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2017251。

本发明还公开了制备PK‐15/PLIN2细胞株的方法，该方法包括如下步骤:

1)PLIN2基因的克隆：根据PLIN2基因序列设计重叠PCR引物，共计34 条，相邻引物之间有17bp反向互补重叠，中间有25bp未互补序列，34条引物拼接成PLIN2基因的全长,将34条引物混合后经过退火处理，相邻引物的17bp 序列互补配对。中间未配对的25bp序列，在高保真酶的作用下序列被补齐，构成完整的双链PLIN2基因的全长序列,经过25个循环后，PLIN2基因得到扩增，然后将扩增获得的片段经电泳检测；

2)利用胶回收试剂盒将扩增获得的PLN2基因片段回收，然后用将该片段与pCDNA3.1-EGFP载体分别经NheI和AflII限制性内切酶酶切，电泳检测回收目的片段后经T4连接酶连接至pCDNA3.1-EGFP载体中，构建成 pCDNA3.1-EGFP-PLIN2质粒，并经测序验证；

3)转染与筛选：转染质粒PLIN2-pCDNA3.1-EGFP至PK-15细胞系，单个细胞克隆化培养法筛选出稳定复制外源PLIN2的PK‐15/PLIN2细胞株。

本发明进一步公开了制备PCV2的方法，该方法包括如下步骤:

1)细胞制备：将PK-15/PLIN2细胞株解冻，培养于克氏瓶中，传代至所需数量；