[发明专利]一种常温保存的细胞冻存液及其应用

说明书

本发明提供了一种可以常温保存的适于单个核细胞的无血清细胞冻存液及其应用，所述无血清细胞冻存液包括以下组分：体积百分数约10％的二甲基亚砜；质量体积比约2.5g/L的葡萄糖；质量体积比约30～40g/L的右旋糖酐；质量体积比约6～12g/L的羟乙基淀粉；体积百分数约25～45％的复方电解质溶液。本发明还提供了上述无血清细胞冻存液的制备方法和采用上述无血清细胞冻存液的冻存方法。本发明的无血清细胞冻存液可以常温下保存或者运输，冻存后复苏细胞活率高，可直接用于临床或后续培养。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体的，本发明涉及了一种可以常温保存的适于单个核细胞的无血清细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

单个核细胞，一般指的是脐带血和外周血中的只有一个细胞核的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞和造血干细胞等等。单个核细胞中的造血干细胞经常用于造血干细胞移植；同时单个核细胞在体外也可经细胞因子刺激诱导成不同的免疫细胞，多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer，CIK)和自然杀伤细胞(naturalkiller cell，NK)等，在临床治疗抗肿瘤方面也具有重大的用途。

在细胞培养技术广泛用于科学研究和临床治疗的令天，细胞的冷冻保存技术和解冻复苏技术显得日益重要。

细胞冷冻保存是指将细胞保存在超低的温度中。细胞的生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期低温保存，在复苏后仍能保存正常的结构和功能。经不断的摸索研究证明，细胞在-196℃的液氮超低温条件下保存，是目前最佳的冷冻保存温度。因为在-196℃时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。

细胞在没有冻存保护剂的情况下，直接冻存，细胞会随着温度的降低，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而死亡，造成细胞冻存失败。细胞冻存过程中加入了冷冻保护剂，则可保护细胞免受冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，是细胞冷冻保存成功。

冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉(HES)等。目前最常用的冷冻保护剂是DMSO。

虽然细胞在冷冻情况下，细胞的新陈代谢极其缓慢，但仍需要一定的营养物质或能量来消耗以维持基本活性。所以现在大多数细胞冻存液会加入胎牛血清(FBS)、培养基、人血清，白蛋白等。由于胎牛血清(FBS)可能携带动物源性病毒的风险，人血清也有可能含有人源病毒，培养基含有各种离子等问题，使目前冻存液的临床使用有种种限制和不方便。

目前有些冻存液，需要在使用前配制终浓度为2倍浓度，放置2-8℃冰箱中预冷一段时间或长期保存，使用时再取出，用溶液重悬细胞后，再加入等量的2倍冻存液，使冻存液终浓度为1倍。该操作不能实现冻存液的现配现用，并且长期低温储存都导致操作繁琐，不利于产品质量控制，易发生污染，易发生失误等问题。

因此，本领域还需要一种更便于储存和使用，并且改善用其冻存和复苏效果的细胞，特别是适合单个核细胞的复苏率和生存率的细胞冻存液。

发明内容

本发明的宗旨在于解决以上所述的现有技术缺陷，提供一种可以现配现用或常温保存下使用的细胞无血清冻存液，特别是适合用于单个核细胞的细胞无血清冻存液。本发明的细胞冻存液和方法进行冷冻和复苏的细胞复苏后的细胞复苏率和生存率很高，并保存良好的细胞活性。

具体的，本发明提供了一种无血清细胞冻存液，其特征在于，包括以下组分：质量体积比约30～40g/L的右旋糖酐。

在本发明的其中一个方面，本发明提供了一种无血清细胞冻存液，其特征在于，包括以下组分：