[发明专利]一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法

权利要求书

1.一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：

二甲基异咯嗪的合成：将1.0-1.2g6，7二甲基-9-甲酸基甲基异咯嗪固体置于烧杯内，加入硼酸溶液和氢氧化钠溶液，避光搅拌反应90-100分钟得二甲基异咯嗪；

二甲基异咯嗪的一次纯化：过滤反应液，将滤液置于分液漏斗中，加入二氯甲烷萃取，反复萃取直至萃取液为无色；在38-40℃温度下用旋转蒸发仪对萃取液旋转蒸发进行浓缩，浓缩液终体积为18-20mL；

二甲基异咯嗪的二次纯化：对浓缩液做薄层层析分离、柱层析分离，层析后得到二甲基异咯嗪的溶液；将溶液在70-74℃旋转蒸发，得到浓缩液，再置于真空干燥箱内以55-58℃干燥得到浅黄色二甲基异咯嗪固体；

小球藻蛋白液的提取：将小球藻在2-4℃、6000-8000r/min条件下离心浓缩8-10分钟，将浓缩液于超声破碎仪中进行细胞破壁，离心提取取上清即为粗蛋白液；

蛋白液的纯化：将蛋白液置于饱和硫酸铵溶液中，经DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，用氯化钠缓冲液梯度洗脱，合并具有酶活的洗脱液，在0-4℃温度下，以磷酸缓冲溶液透析过夜，得纯化后的蛋白液；

试剂的复配：在蛋白液中加入十二烷基硫酸钠、二甲基异咯嗪粉末，搅拌均匀，静置30-45分钟，加入稳定剂，即得针对多换芳烃特异性降解的试剂。

2.根据权利要求1所述的一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，其特征在于：所述二甲基异咯嗪的合成步骤中硼酸溶液的浓度为0.10-0.12M，体积为30-32mL；氢氧化钠溶液的浓度为0.1-0.12M、体积为130-135mL。

3.根据权利要求1所述的一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，其特征在于：所述二甲基异咯嗪的二次纯化步骤中薄层层析分离的薄层厚度为0.18-0.25mm，柱层析的固定相为硅胶，流动相为重量比为6-8:3-5:1的正丁醇、甲醇、蒸馏水。

4.根据权利要求1所述的一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，其特征在于：所述小球藻蛋白液的提取步骤中，细胞破碎仪功率为1.0-1.2kW，探头振幅为35-38%，破碎时间为30-45分钟。

5.根据权利要求1所述的一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，其特征在于：所述小球藻蛋白液的提取步骤中，离心提取的温度为2-4℃，转速为10000-13000r/min，提取时间为15-20分钟。

6.根据权利要求1所述的一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，其特征在于：所述蛋白液的纯化步骤中氯化钠缓冲液的浓度梯度为0-700mmol/L。

7.根据权利要求1所述的一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，其特征在于：所述蛋白液的纯化步骤中的磷酸缓冲溶液的浓度为1.0-1.3mM，pH为7.4-7.6。

8.根据权利要求1所述的一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，其特征在于：所述试剂的复配步骤中，十二烷基硫酸钠的添加量为50-55mg，二甲基异咯嗪粉末的添加量为0.5-0.6g。

9. 根据权利要求1所述的一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，其特征在于：所述试剂的复配步骤中，稳定剂为10-12%甘油、2.0-2.3mMEDTA、0. 5-0.6mMDTT的混合液，pH为7.6-7.8。