[发明专利]一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法

说明书

本发明提供了一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法。该方法主要包括：明胶甲基丙烯酰胺材料的合成、明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核内细胞负载、细胞3D单独/共培养等。本发明实现一步、可控、制备核壳微球，并用于细胞3D培养，基于材料良好的生物相容性，该发明在细胞培养、微组织模型构建、组织块移植、药物缓释与筛分等生物学应用方面具有极大的应用价值。

技术领域

本发明涉及材料化学与微流控技术领域，具体涉及一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法。

背景技术

体外构建功能化的组织模型在组织工程、组织块移植、伤口愈合、药物筛分等领域已被广泛关注。在体内，功能化组织涉及多种类型的细胞以及细胞与细胞外基质间的相互作用。此外，在体外构建功能化组织中，细胞外基质也提供了3D支架材料，并用于实现一种或多种细胞的培养。

水凝胶材料作为细胞3D培养支架材料，已经在细胞培养、组织块移植等方面得到了广泛的应用。而目前用到的用于细胞3D培养的水凝胶材料主要分为天然水凝胶材料和人工合成水凝胶材料两种。天然材料主要为明胶、海藻酸盐、胶原等，人工合成的材料主要为聚乙二醇(PEG)材料。无论是天然材料还是人工合成的材料在用于负载细胞时均需考虑到材料的生物相容性、可降解性、机械强度等因素。目前应用最为普遍的是海藻酸盐与明胶，由于其极好的生物惰性与机械强度，在用于细胞负载时形成的微球只是作为3D的支架材料，而缺乏支架材料与细胞之间的相互作用，且海藻酸盐材料降解性差，在用于体内移植时会存在支架材料残留在体内而难降解得问题。而明胶材料因包含许多能促进细胞粘附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列故具有很好的生物相容性；因含有适合细胞重新构造的基质金属蛋白酶(MMP)序列故可降解；因含有很多氨基、羧基、羟基，故可用于修饰嫁接官能团。但由于其低温呈现固态、高温呈现液态的性质，在用于细胞37℃培养时为液态，不能形成稳定的支架材料。然而，明胶用甲基丙烯酸酐修饰后在光引发剂存在的条件下，紫外条照射发生自由基聚合反应，从而将明胶固化，即形成明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料，能很好的用于细胞37℃培养。

传统的微球制备方法主要是悬滴法与机械搅拌法，由于存在可控性差、均一性差的问题而在用于细胞3D培养方面受到限制，随后微孔膜新技术的提出虽然微球粒径的可控性和均一性都很好，但是在小体系下做到粒径的可控性和均一性还相对较差。而微流控体系因其在微米尺度下对流体精确控制的特点能韩浩解决传统技术存在的瓶颈问题。当前，基于微流控技术制备的明胶甲基丙烯酰胺材料，用于细胞3D培养主要是实心微球内负载细胞，而实心微球用于细胞3D培养存在流体剪切力对细胞的损伤、细胞在微球内生长的不可控、等缺点，所以核壳微球的构建解决了以上问题。本发明基于微流控技术提出制备明胶甲基丙烯酰胺核壳微球并用于细胞3D培养。

发明内容

本发明提供了一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，致力于提出一种将生物相容性很好水凝胶材料用于细胞3D单独/共培养的的方法。

本发明一种微流控芯片，主要由连续相入口、壳流体入口、核流体入口、微球出口、连续相通道、壳流体通道、核流体通道、层流通道及主通道组成连续相入口通过连续相通道与主通道连接，壳流体入口、核流体入口分别通过壳流体通道、核流体通道均与层流通道及主通道连接。

所述的微流控芯片，连续相通道、壳流体通道、核流体通道、层流通道、主通道宽度范围均为100-500μm，芯片各部分通道高度范围为50-400μm，主通道长1-2cm，层流通道长范围为0.5-1.5mm。

一种微流控芯片的制备方法，该微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为洁净的玻璃片。PDMS层和玻璃片分别用等离子体处理15s进行封接，通道用1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷疏水处理。所述1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷浓度为0.5％-5％。

本发明一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，采用上述微流控芯片，具体包括下列步骤：