[发明专利]一种永生化奶牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体动物细胞工程技术领域，涉及一种永生化奶牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法。

背景技术

瘤胃是反刍动物消化、吸收和代谢营养物质的重要场所。瘤胃上皮有着重要的生理功能，如营养物质的转运吸收、短链脂肪酸(Short chain fatty acid，SCFAs)的吸收代谢和瘤胃微生物的粘附。瘤胃上皮SCFAs的吸收是最为重要的生理功能，这是因为SCFAs能够为反刍动物提供70％的主要能量来源和提供合成乳脂的前体物质。瘤胃上皮对营养物质转运吸收机制的研究以及涉及瘤胃上皮SCFAs转运蛋白和受体蛋白基因功能的研究仍然未被报道。基于以上分子机制的研究，申请人需要建立一个稳定且连续传代的奶牛瘤胃上皮细胞系(Bovine rumen epithelial cells，BRECs)。之前的研究者已经报道了关于奶牛、山羊和绵羊的瘤胃上皮细胞原代培养，然而，以上的研究仅仅培养原代瘤胃上皮细胞且原代瘤胃上皮细胞培养几天之后，细胞出现无法增殖、衰老和凋亡的现象。此外，到目前为止，国内外还未建立一个永生化的BRECs系。因此，建立一个连续传代的永生化BRECs对于通过CRISPR/Cas 9系统研究瘤胃上皮基因的功能能够提供细胞素材，这对于进一步研究奶牛瘤胃上皮转运蛋白和受体蛋白的功能具有重要意义。

国内外已经报道了从奶牛、山羊和绵羊的瘤胃上皮分离了瘤胃上皮细胞，这些方法主要是通过胰酶消化来获得瘤胃上皮细胞。通过胰酶来消化成年绵羊的瘤胃组织获得了瘤胃上皮细胞，并利用胰岛素和葡萄糖来进行刺激瘤胃上皮细胞，结果表明胰岛素和葡萄糖提高了M1期(Sakata T,Hikosaka K,Shiomura Y,et al.Stimulatory effect of insulin on ruminal epithelial cell mitosis in adult sheep[J].British Journal of Nutrition,1980,44(3):325-331)。分离获得奶牛瘤胃细胞主要由棘层、基底和层状颗粒层的瘤胃细胞构成(Gálfi P,Neogrády S and Kutas F.Culture of epithelial cells from bovine ruminal mucosa[J].Veterinary Research Communications,1980,4:295-300)。通过2％胰蛋白酶、1％的透明质酸酶和1％弹性蛋白酶联合消化绵羊瘤胃组织15min，消化两次是为了去除瘤胃角质层的角质细胞。随后，再利用2％胰蛋白酶消化瘤胃组织6次，每次消化15min，最终能够获得绵羊瘤胃上皮细胞(Baldwin RL and Jesse BW.Technical note:isolation and characterization of sheep ruminal epithelial cells[J].Journal of Animal Science,1991,69:3603-3609)。利用含有5％的胰蛋白消化小母牛瘤胃上皮两次,每次15min，之后用1mm的尼龙网过滤。随后，剩余的瘤胃上皮继续用5％的胰蛋白酶消化，使用300μm尼龙网过滤移除其他的瘤胃粘膜组织，最终能够获得一定纯度的瘤胃上皮细胞(Klotz JL,Baldwin RL,Gillis RC,et al.Refinements in primary rumen epithelial cell incubation techniques[J].Journal of Dairy Science,2001,84:183-193；Wang A,Jiang H.Rumen fluid inhibits proliferation and stimulates expression of cyclin-dependent kinase inhibitors 1A and 2A in bovine rumen epithelial cells[J].Journal of Animal Science,2010,88:3226-32)。采集42日龄的山羊瘤胃上皮组织，使用含有0.25％胰酶和0.02％EDTA消化液消化山羊瘤胃上皮，消化两次，每次15min，之后，弃掉2次消化液。接下来，用相同消化液再次消化3次。每次15min，最终能够获得细胞活力较强的瘤胃上皮细胞。同时，也利用组织块培养法来培养瘤胃上皮细胞，接种组织块4天之后，瘤胃上皮细胞能够从组织块周围辐射出来。培养至第8天，瘤胃上皮细胞增殖较快并形成细胞团。此外，这个研究也发现，组织块培养法获得的瘤胃上皮细胞比酶消化法获得的瘤胃上皮细胞增殖能力强(刘思乐,康劲翮,谭支良,等.不同培养方法对山羊瘤胃上皮细胞生长及角蛋白18表达量的影响[J].动物营养学报,2016,28(4):1225-1232)。分离成年牛瘤胃上皮细胞研究表明，6倍的青霉素、链霉素和庆大霉素能够有效地去除瘤胃上皮组织的微生物，排除了分离瘤胃上皮细胞的污染的风险。瘤胃上皮经过0.1％的胶原酶消化30min之后，再用0.25％胰酶和0.02％EDTA分步消化能够获得较多的瘤胃上皮细胞且细胞活力较强(余燕,李元晓,李旺,等.成年牛瘤胃上皮细胞原代培养方法研究[J].中国兽医学报,2016(5):869-874)。同时，也有研究者在分离山羊瘤胃上皮细胞过程中，首先用高浓度的2.5％的胰蛋白酶和0.02％EDTA消化山羊瘤胃上皮，然后再用0.2％胶原酶IV和0.5mmol/L CaCl₂来消化瘤胃上皮，最终能够得到纯度高且活力强的山羊瘤胃上皮细胞(孙志洪,张庆丽,贺志雄,等.山羊瘤胃上皮细胞和空肠黏膜上皮细胞原代培养技术研究[J].动物营养学报,2010,22(3):602-610)。尽管，瘤胃上皮细胞的原代培养已经被建立，但是，这些瘤胃上皮细胞经过数次分裂之后，大量的原代瘤胃上皮细胞无法增殖且伴随着细胞凋亡。最终，导致涉及瘤胃上皮细胞的分子机制研究无法进行，如利用CRISPR/Cas9系统来研究瘤胃上皮转运蛋白和受体蛋白的功能以及SCFAs吸收代谢机理。同时，国内外永生化的BRECs细胞系还没见报道。因此，建立永生化的BRECs可为进一步研究瘤胃上皮基因的功能、营养素吸收代谢和微生物粘附机理研究提供功能性的细胞素材。若无细胞素材，只能对活体奶牛进行采样，此过程繁琐复杂且胰蛋白酶培养原代细胞时间较长。同时，目前BRECs并没有商品化，因此，建立功能性的永生化奶牛瘤胃上皮细胞迫在眉睫。