[发明专利]九子连环草甘露糖结合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学基因工程技术领域，具体涉及一种编码九子连环草甘露糖结合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。

背景技术

九子连环草，Calanthe discolor Lindl.，属于兰科植物，是一种传统的中草药，性温，味甘辛，无毒。可用以散结，解毒，活血，舒筋。九子连环草作为一种常用中药材，所含甘露糖结合蛋白丰度很低，但其凝血活性很强。单子叶甘露糖结合蛋白家族，是植物蛋白里的一个十分重要的家族分支，其组成成员十分庞大。这一家族的蛋白具有专一特异性结合甘露糖或甘露寡糖的能力，并且广泛分布于单子叶植物中，同时还具有多种十分有价值的生物学活性，如抗真菌活性及抗虫活性等。Van Damme,Balzarini J,Smeets等人先后从兰科植物火烧兰和二叶兰的块茎中分离出两种以单体形式存在的抗真菌甘露糖结合蛋白(EHMBP和LOMBP)。目前，还没有关于编码兰科植物九子连环草甘露糖结合蛋白的基因全序列报道。

发明内容

鉴于上述不足之处，本发明的目的在于提供一种编码九子连环草甘露糖结合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。

本发明所述九子连环草甘露糖结合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

本发明所述九子连环草甘露糖结合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

本发明通过从九子连环草新鲜嫩叶组织中提取的RNA，利用同源克隆和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术，快速克隆编码九子连环草甘露糖结合蛋白的基因。

本发明具有以下有益效果：

使用本发明所述技术方法和引物能够快速准确地获得一种兰科植物九子连环草甘露糖结合蛋白的基因全长序列及氨基酸序列。丰富了植物甘露糖结合蛋白家族成员信息，为后续应用和研究提供技术支持。

附图说明

图1是提取的九子连环草嫩叶组织的总RNA电泳图谱，

图2是对九子连环草甘露糖结合蛋白基因进行3’RACE克隆片段的电泳图谱，其中A图是第一轮扩增的PCR产物；B图是第二轮扩增的PCR产物。

图3是对九子连环草甘露糖结合蛋白基因进行5’RACE克隆片段的电泳图谱。

图4是九子连环草甘露糖结合蛋白的核苷酸序列(cDNA全长)的电泳图谱。

具体实施方式

1.材料和方法

1.1材料

植物材料：九子连环草新鲜嫩叶组织：直接剪取。

菌株：所用克隆菌株为大肠杆菌(Escherichia coli(Migula)Castellani et Chalmers)Top 10。

质粒：pEASY-T1 Cloning Vector，大小为3928bp，具有氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Kal)两种筛选标记，便于重组子的筛选，具有带游离T的5’-黏性末端，为PCR产物的专用克隆载体(购买于北京全式金生物技术有限公司)。

试剂盒和酶：Trizol试剂购买自Invitrogen公司；小量胶回收试剂盒购于Axygen公司。

T4 DNA Ligase、M-MLV反转录酶、TdT(核苷酸末端转移酶)、Ribonuclease Inhibitor、EasyTaqDNA Polymerase、EasyPfuDNA Polymerase及Fermentas限制性内切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ均购自北京全式金生物技术有限公司。

其余化学药品均为分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1九子连环草总RNA的提取

九子连环草总RNA的提取过程参照InvitrogenTrizol试剂盒的说明，如下：

(1)取0.1mg左右新鲜的或-80℃低温保存的九子连环草嫩叶组织迅速置于充满液氮的研钵中，将组织充分研磨成粉末状；

(2)用药匙将粉末分装到两个液氮预冷过的1.5mL离心管中，并向其中加入1mL的Trizol试剂，充分震荡混匀，置于冰上约5min；

(3)向管中加入200μl氯仿，充分混匀后放置5min，然后在4℃，12，000g离心5min；

(4)将上层水相转移到新的已预冷过的离心管中，加入500μl异戊醇，充分混匀后放置5min，然后在4℃，12，000g离心5min；

(5)倒掉上清，加入75％乙醇将沉淀悬起，4℃，7，500g离心3min；

(6)重复步骤5；