[发明专利]重组人乳头瘤病毒45亚型蛋白表达

说明书

本发明公开了一类经密码子优化而适于在毕赤酵母中表达HPV45型人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因，以及含有该基因的载体、菌株及表达该基因的方法。本发明还公开了一种具有免疫原性的大分子，其主要由所述经密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因在酵母细胞中表达产生。本发明还公开了所述具有免疫原性的大分子的应用和组合物。

技术领域

本发明涉一种新的毕赤酵母表达系统,其可用于生产重组人乳头瘤病毒45亚型病毒样颗粒。

背景技术

宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科恶性肿瘤，全球每年有超过50万的妇女被诊断出患有宫颈癌，27万妇女死于此病，年龄标准化感染率达10.5％。早在80年代初，Haraldzur Hausen就发现人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的感染与宫颈癌发病有关，后续的大量研究也已证明HPV与宫颈癌及其癌前病变有密切联系。到目前为止，已发现了百余种HPV基因型，其中约40种可以感染生殖道粘膜。其中高危型HPV型别为HPV16、18、31、33、45、52和58，90％以上的宫颈癌与它们有关。

根据2010年WHO的报告，HPV45在中国妇女中HPV感染亚型的发生率为2.3％，属于在中国发生率较高的HPV亚型(China Human Papillomavirus and Related Cancers,FactSheet 2010,WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer,Sep 15,2010)。

HPV是无包膜二十面体对称病毒，其病毒基因组DNA为闭合环状，长度约7200-8000bp，由早期编码区(early region)、晚期编码区(late region)和位于两者之间的长调控区(long control region)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框(ORF)，编码病毒衣壳蛋白L1和L2。L1蛋白分子量约55kDa，为主要衣壳蛋白，以72个五聚体的形式支撑整个病毒衣壳结构，在不同型别中氨基酸序列高度保守，能够刺激机体产生保护性抗体。L2蛋白分子量较小，多位于L1蛋白内部。

昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒(VLP)。L1单独表达得到的VLP与天然病毒衣壳结构类似，可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。

因此，鉴于L1蛋白于不同基因型别内部高度保守，并且能够单独表达形成VLP，以L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过，以表达重组病毒蛋白得到的VLP作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题，其中首先需要解决的技术问题就是如何提高重组病毒蛋白的表达水平。而L1蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒等表达系统中，往往受到这些生物体内氨基酸密码子使用频率的限制导致表达水平较低甚至无表达。如Merck公司的美国专利No.7,498,036中记载，野生型VLP蛋白在酿酒酵母中的表达量为35μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)左右。

因此，本领域中需要一种高水平在毕赤酵母中表达HPV45L1基因的方法，所述方法应该能够高水平地、操作简便和低成本地表达HPV45L1基因。

发明内容

为了解决上述技术问题，根据本发明的第一方面，提供了一种能够在毕赤酵母中高效表达的HPV45基因，所述基因具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。