[发明专利]一种测定线粒体泵氢能力的新方法

说明书

本发明公开了一种测定线粒体泵氢能力的新方法，属于科研实验领域，包括以下步骤：S1：将磁力搅拌器置于分光光度计比色杯架下方；S2：将分光光度计设置到时间扫描状态；S3：将比色杯放入分光光度计中，并加入KCl，启动磁力搅拌器，开始扫描；S4：加入8‑羟基‑1,3,6‑三磺酸芘；S5：加入亚铁细胞色素c、缬氨霉素、2,3‑二甲氧基‑5‑甲基‑6‑(10‑溴基)‑1,4‑苯醌和线粒体溶液；S6：吸收线走平后记录吸收值A₁；S7：加入1μl 5mM的铁氰化钠，记录吸收值A₂；S8：加入质子载体羰基氰化氯苯腙，记录吸收值A₃；S9：加入铁氰化钠，记录吸收值A₄；S10：计算泵氢能力(H⁺/e)＝x/y＝(A₁‑A₂)/(A₃‑A₄)。本方法设计合理，操作简单，受环境干扰小，测定结果的精确度和重复性好，适合一般实验室应用。

技术领域

本发明涉及科研实验技术领域，具体是涉及一种测定线粒体泵氢能力的新方法。

背景技术

生物体通过呼吸作用将糖类、蛋白质、脂肪等营养物质氧化分解，同时通过氧化磷酸化，将这些有机物中储藏的能量转化为化学能，不断供给生理活动的需要。

这些过程主要是在线粒体中进行和完成的。线粒体进行电子传递时，会同时将线粒体中的H⁺泵到线粒体膜外，这样就形成了膜内外的H⁺浓度差，即质子动力势。在质子动力势的推动下，线粒体内膜上的ATP酶就可以合成ATP，ATP是生物体各种生命活动的直接能量来源。因此，线粒体被看作是细胞内的“动力工厂”。研究线粒体的泵氢能力是研究线粒体结构和功能的重要环节。

传统的研究线粒体泵氢能力的方法是酸度计法，此法需要多种仪器的配合，如高灵敏度酸度计、磁力搅拌器、记录仪等，实验结果受电磁、震动等外界环境的影响较大。另外，操作过程也过于复杂。这些都降低了实验结果的重复性和可靠性。

发明内容

本发明解决的技术问题是：现有技术中的研究线粒体泵氢能力的方法操作复杂，受干扰因素多，导致结果误差大，降低了重复性和可靠性；进而提供了一种测定线粒体泵氢能力的新方法。

本发明的技术方案如下：

一种测定线粒体泵氢能力的新方法，包括以下步骤：

S1：将磁力搅拌器置于分光光度计比色杯架下方；

S2：将分光光度计设置到时间扫描状态，扫描波长为475nm；

S3：将比色杯放入分光光度计中，并加入1.6ml 150mM KCl作为反应液；把磁力搅拌器转子放入比色杯中，并启动磁力搅拌器；然后调零，开始扫描；

S4：往比色杯反应液中加入5.7μl 14mM的8-羟基-1,3,6-三磺酸芘，使之终浓度为50μM；

S5：待吸收线走平后，往比色杯反应液加入2μl 2mM的亚铁细胞色素c、2μl 0.2mg/ml的缬氨霉素、5μl 5mM的2,3-二甲氧基-5-甲基-6-(10-溴基)-1,4-苯醌和50μl 0.5g/ml的线粒体溶液；

S6：待吸收线走平后，记录吸收值A₁；

S7：往比色杯反应液中加入1μl 5mM的铁氰化钠，启动反应；待反应完毕吸收线变平时，记录吸收值A₂；

S8：往比色杯反应液再加入2μl 0.25mg/ml的质子载体羰基氰化氯苯腙；待吸收线变平后，记录吸收值A₃；

S9：往比色杯反应液中再加入1μl 5mM的铁氰化钠，启动反应；待反应完毕吸收线变平时，记录吸收值A₄；