[发明专利]促皮质素与胰岛素样生长因子1融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域。具体涉及DNA及蛋白质一级结构、表达载体的 构建和表达、以及蛋白质的分离和纯化。

背景技术

促皮质素(Corticotropin)，也称促肾上腺皮质激素(ACTH，adrenocorticotropic hormone)，是由垂体的前叶、下丘脑、肾上腺髓质、肠道和胎盘等组织分泌的一种39 个氨基酸的多肽类激素，具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢，调节心脑血 管功能、提高抵抗力，调控糖皮质激素(GC)的合成与分泌，神经损伤恢复与再生， 抗炎，免疫抑制，抗毒素，抗休克等作用。ACTH是临床治疗两岁以下婴儿惊厥症的唯 一特效药，该病发病率0.5％～1％，6～33％的婴儿惊厥症患儿在3岁前死亡，70～90 ％患儿智力发育缓慢，30％发展为自闭症。ACTH也用于红斑狼疮、多发性硬化病急性 恶化、肾病综合征、全身性皮肌炎和结节病的治疗；还用于银屑病关节炎、风湿性关节 炎、强直性脊柱炎以及严重眼部过敏和炎症等的辅助治疗。ACTH不稳定，体内半衰期 只有15分钟；目前临床应用的ACTH是从动物组织中提取的，生产成本高并且有传播 动物病毒和支原体的潜在风险。本发明从工程菌中表达制备基因重组ACTH融合蛋白， 生产成本低，基本不会传播动物病毒和支原体。

胰岛素样生长因子1(IGF-1，insulin-like growth factor 1)，又被称作促生长 因子或生长激素介质(Somatomedin)，含有70个氨基酸，相对分子量为7649的多肽类 激素，其半衰期长达20个小时，其作用与胰岛素类似，IGF-1单独应用能够将ACTH 的作用提高20倍。IGF-1在人体中的主要作用为调节血糖、促生长、促细胞分化、创伤 修复等。IGF-1制剂在临床上已用于治疗糖尿病、胰岛素抵抗综合征、侏儒症及神经系 统疾病等多种顽疾，取得了良好的效果。本发明将ACTH与IGF-1融合表达并纯化。得 到的融合蛋白不但能够增强ACTH的作用，还具有ACTH与IGF-1的双重药理作用。

初始表达架构为HisTag-linker-EKst-ACTH-IGF-1。其中HisTag为组氨酸标 签，linker为随机连接序列，EKst为肠激酶(Enterokinase)底物序列(氨基酸序列为 DDDDK)。肠激酶能够特异性的切割其底物序列氨基酸序列末端，得到不含多余氨基酸 的ACTH-IGF-1融合蛋白。

发明内容

1.发明的目的

利用工程菌中表达并纯化出一种基因重组融合蛋白(ACTH-IGF-1)，及其制 备和纯化方法。

2.发明的技术方案

一、使用重叠PCR技术将ACTH与IGF-1相连，构建两端带有内切酶位点 (BamH1和Sal1)的cDNA架构：BamH1-HisTag-linker-EKst-ACTH-IGF-1-Sal1，此架 构中ACTH前插入了编码肠激酶底物(EKst)的碱基序列，EKst前面插入编码组氨酸 标签(HisTag)的碱基序列，ACTH与IGF-1之间以柔性连接序列GGGS相连。

二、双酶切Bamh1-HisTag-linker-EKst-ACTH-IGF-1-Sal1和载体pET30a，产 生粘性末端。

三、用T4连接酶构将切出粘性末端的BamH1-HisTag-linker-EKst-ACTH-IGF- 1-Sal1以及质粒pET30a连接，构建出表达HisTag-linker-EKst-ACTH-IGF-1的pET30a 质粒(图1)。

四、将构建好的质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，筛选高表达菌株， 诱导表达。

五、破碎菌体，收集包涵体并洗涤，再破碎和溶解包涵体，得到富含 HisTag-linker-EKst-ACTH-IGF-1的溶液。

六、利用镍(Ni)柱纯化出HisTag-linker-EKst-ACTH-IGF-1。

七、用带有His标签的肠激酶切割HisTag-EKst-ACTH-IGF-1，得到 ACTH-IGF-1融合蛋白。

八、用镍柱去除带有His标签的肠激酶以及切下来的HisTag-linker-EKst，得 到纯化的ACTH-IGF-1。

3.发明的有益效果

本发明可以获得具有ACTH和IGF-1双重功效的融合蛋白IGF-1-ACTH，可 以增强ACTH的作用。

附图说明

图1.HisTag-linker-EKst-ACTH-IGF-1pET30a质粒图谱。