[发明专利]一种用于诊断牛结核病的流式细胞术检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别是涉及一种用于诊断牛结核病的流式细胞术(FCM)检测试剂盒及其在牛结核病诊断领域的应用。

背景技术

牛结核病是一种主要由牛分枝杆菌引起的慢性消耗性人兽共患传染病，我国将其列为二类动物疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列为需通报的动物疫病。该病一年四季均可发生，呈世界性流行。牛分枝杆菌不仅导致了牛自身生产力的下降，更重要的是对人类健康构成了严重的威胁。因此，无论从畜牧业还是从公共卫生角度，加大对牛结核病的研究都有着迫切的需求和深远的意义。而建立快速、特异性强、敏感度高的检测方法是牛结核病检疫中的关键步骤，也是临床中亟待解决的问题。

白细胞介素2(Interleukin-2，IL-2)主要是由T淋巴细胞分泌的一种淋巴因子，在T细胞增殖、B细胞发育、NK细胞的活化等方面起重要作用，是一种能影响机体免疫反应各个方面的调节因子。牛感染牛分枝杆菌后，主要诱导机体产生Th1型细胞免疫应答反应，IL-2作为Th1型细胞免疫应答产生的主要细胞因子之一，其分泌水平反映着机体感染牛分枝杆菌的不同状态。通过对牛白细胞介素2(boIL-2)的分泌水平进行检测，这将在牛感染性疾病的诊断和免疫状态的评价中发挥着重要的作用。

目前应用于临床诊断牛结核病的主要方法为牛结核菌素皮内变态反应试验和体外γ-干扰素释放试验。而两种方法中使用的结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)成分复杂，包含的很多蛋白同时存在于致病分枝杆菌和非致病分枝杆菌中，不能区分结核阳性感染、免疫个体以及环境分枝杆菌感染等情况，从而限制了检测方法的特异性和敏感性。此外，ELISA检测方法是群体水平的检测。如果群体细胞因子水平提高，既有可能是分泌细胞因子的细胞数量增加，也有可能是分泌细胞的数量没增加而单个分泌水平增加，易造成假阳性。

因此，需要建立特异性更好的试剂盒用于牛结核病的检测。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种针对牛结核病的FCM检测试剂盒，该试剂盒能够对牛结核病进行高特异性地检测。

本发明的第一方面涉及一种用于诊断牛结核病的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括：支持介质、荧光标记的CD4表面分子抗体、检测抗体、特异性刺激剂，其中，所述检测抗体能特异性结合并检测牛细胞白介素2，特异性刺激剂为CFP-10和ESAT-6的融合蛋白。

本发明的第二方面涉及上述FCM检测试剂盒在用于非诊断目的的牛分枝杆菌感染检测中的应用，其中，所述非诊断目的包括流行病学分析和研究、离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量检验牛分枝杆菌抗原特异的boIL-2。

本发明的技术效果：

1)本发明试剂盒中所采用的由杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势；

2)本发明试剂盒中所采用的牛分枝杆菌特异性抗原CFP-10、ESAT-6由RD1基因编码，RD1只存在于结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌，而在卡介苗BCG中缺失，因此CFP-10和ESAT-6作为刺激剂特异性更高；

3)本发明是基于牛分枝杆菌特异性抗原的FCM检测试剂盒，相比于单纯颈部皮内变态反应试验和BOVIGAM^TM(Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for Cattle)ELISA检测试剂盒，能够实现从单个细胞水平对特定亚型淋巴细胞分泌IL-2水平的检测，排除了交叉反应和假阳性的干扰，显示出良好的特异性；

4)该试剂盒还支持大批量样品的快速检测，同时相比较于其他细胞因子检测试剂盒，该试剂盒仅需一种细胞因子抗体，节约了成本；

5)此外，该试剂盒的使用过程中可以将表面和胞内的染色同时进行，大幅缩减了试验所需时间，简化了操作步骤，降低了操作误差，提高了灵敏度和分辨率。

附图说明

图1为实施例7中根据本发明的FCM检测试剂盒的牛外周血单个核细胞(PBMC)样品检测结果图：A.未刺激牛PBMC检测结果；B.ConA刺激牛PBMC检测结果；

图2为实施例8中根据本发明的FCM检测试剂盒的牛外周血单个核细胞(PBMC)样品检测结果图：A.未刺激牛PBMC检测结果；B.ConA刺激牛PBMC检测结果；C.CFP-10和ESAT-6的融合蛋白刺激牛PBMC检测结果。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。