[发明专利]贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶发酵液的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说是一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法及在促进乳猪生长中的应用。

背景技术

蛋白酶是催化蛋白水解的一类酶，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，广泛应用于食品、纺织、医药、有机合成、洗涤剂及制革脱毛等领域，其份额占整个酶制剂市场的一半以上。蛋白酶可以从动植物中提取，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等；也可以通过微生物发酵工艺进行生产，如固态发酵法和液态发酵法等。

益生菌的代谢产物能促进动物生长，抑制病害发生。可以提高动物对于饲料的利用水平，提高利用率，从而降低购买饲料的成本；益生菌可以除臭，改善饲养环境；还能够增进动物健康，有效控制预防细菌和寄生虫以及呼吸系统疾病的预防；促进动物快速生长，从而缩短饲养的时间；减少使用抗生素，提高禽肉蛋、绿色禽畜产品的质量。

贝莱斯芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界。贝莱斯芽孢杆菌具有十种不同的抗生素合成能力，包括一些聚酮类化合物、脂肽类化合物、多肽类化合物等，是一种具有高效生防性能和植物促生活性的土壤细菌。目前，关于贝莱斯芽孢杆菌的报道多集中于其生防功能的研究。但对该菌产蛋白酶的条件及在动物生长中的应用还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，通过对发酵培养基及培养方法的优化以提高贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶的能力，并将该发酵培养液添加入乳猪日粮中以促进乳猪的生长。

所述贝莱斯芽孢杆菌分离自猪粪中，其基因如序列SEQ ID No：1所示。

所述贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，具体包括如下步骤：

A、将分离自猪粪便中的贝莱斯芽孢杆菌接种于发酵培养基中，于21℃-53℃下发酵培养48-72h，

B、经步骤A发酵后，将发酵液于4℃、4000rpm条件下离心20min，取上清液，即得发酵液。

进一步，所述发酵培养基是由碳源、氮源和金属离子配制而成的水溶液；；所述碳源和氮源总质量与水的比例为1g：50ml；所述碳源、氮源的质量比为2：3；所述金属离子加入量与水的比例为1g：100ml。

进一步，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉的组合物，按质量比2.5：3：3.8比例混合而成。

进一步，所述氮源为黄豆粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏的组合物，按质量比3：0.5：1.25:0.75比例混合而成。

进一步，所述金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、Cu²⁺离子组合物，按摩尔比2：1：1：0.75比例混合而成。

进一步，所述培养基的pH值为7.0。

本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，通过对发酵培养基及培养方法的优化以提高贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶的能力，并将该发酵培养液添加入乳猪日粮中以促进乳猪的生长。

本发明贝莱斯芽孢杆菌为芽孢杆菌一个新的品种，它可以产生能诱导全身抗性并同时抑制真菌生长的化合物，能够直接抑制真菌和细菌病原体的生长，并可以使猪尽量免于真菌和细菌的侵害。加入饲料也可以减少对猪抗生素的使用，可以保护猪的肝脏，减少抗生素对肝脏的损害。

附图说明

图1是菌株筛选结果(10^-5平板)。

图2是四区划线法对筛选出的单菌落进行纯化的结果。

图3是革兰氏染色镜检结果。

图4是PCR扩增产物电泳图。

图5是阳性克隆菌落PCR结果。

图6是发酵培养时间对酶活力的影响。

图7是发酵培养温度对酶活力的影响。

图8是发酵培养pH对酶活力的影响。

图9是发酵培养装液量对酶活力的影响。

图10是发酵培中碳氮源比例变化对酶活力的影响。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施例对本发明技术方案做进一步解释说明。

实施例1菌株的分离鉴定

1材料与方法

1.1实验材料

干燥猪粪。

1.1.1实验主要试剂

琼脂粉、LB肉汤、细菌基因组DNA快速提取试剂盒、多功能DNA纯化回收试剂盒、琼脂糖G-10、Premix Taq酶、6×loading buffer、DNA marker、AL 2000、革兰氏染色液。