[发明专利]前列腺癌特异性外泌体、lncRNA及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种前列腺癌特异性外泌体的制备方法。本发明还公开了一种前列腺癌特异性外泌体及其应用。本发明还公开了一种前列腺癌外泌体中的长链非编码RNA SAP30L‑AS1和SChLAP1的制备方法。本发明还公开了前列腺癌外泌体中的长链非编码RNA SAP30L‑AS1和SChLAP1表达量的试剂在制备用于前列腺癌诊断试剂中的应用。本发明还公开了一种前列腺癌诊断试剂盒。本发明可以成功分离前列腺癌患者血浆中前列腺癌特异性外泌体，并进行长链非编码RNA SAP30L‑AS1和SChLAP1的检测。本发明的诊断效能及灵敏度和特异度均显著提高。

技术领域

本发明属于生物技术和肿瘤分子生物技术领域，具体涉及前列腺癌特异性外泌体、lncRNA及其制备方法和应用，尤其涉及用双抗体偶联免疫磁珠的方法分离前列腺癌患者血浆中肿瘤来源外泌体及其lncRNA SAP30L-AS1和lncRNA SChLAP1作为前列腺癌诊断标志物及用于前列腺癌早期诊断的试剂盒。

背景技术

根据最新的癌症统计数据分析，前列腺癌(PCa)是世界上男性癌症死亡的主要原因之一，2016年，美国新增前列腺癌病例约占新诊断癌症患者人数的21％，我国前列腺癌的发病率也迅速上升。在早期阶段前列腺癌的主要治疗方法是去势治疗，但是在晚期阶段进展为去势抗性前列腺癌(CRPC)，中位生存期仅约为2至3个月。目前，前列腺特异性抗原(PSA)的血浆定量检测使众多前列腺癌患者得以诊断，但由于PSA具有前列腺组织特异性，因此在某些良性病变如良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎中升高，导致其特异性下降，假阳性会引起患者不必要的有创活检和过度治疗。因此寻找早期诊断前列腺癌的分子标志物是前列腺癌研究的重点。

外泌体是一种由多种细胞分泌并可以在多种组织细胞间传递的30～100nm的囊泡，存在于血液、尿液、唾液和乳汁等多种体液中，其含有脂质、供体细胞来源的特异性蛋白质、以及longnon-coding RNA、microRNA等非编码RNA和DNA等。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200个核苷酸、不具备蛋白编码能力的转录本。随着癌症转录组研究的进展，发现lncRNA在人类基因转录、转录后调节、细胞生长、增殖、分化及表观遗传方面起着重要作用，且具有复杂的生物学功能，与疾病的发生、发展、诊断及治疗密切相关。而外泌体可以为细胞外核酸提供保护，还能作为有效的载体将其转运到靶细胞中，肿瘤来源的外泌体由于RNA含量较高，且在肿瘤自身的遗传信息传递中发挥重要作用，调控细胞功能与肿瘤微环境，影响肿瘤发生、发展、转移。以往研究表明，在乳腺癌中，lncRNA-21A可能通过调节着丝粒蛋白F(CENP-F)的表达而影响细胞的增殖,当乳腺癌细胞吞噬富lncRNA-21A的外泌体后，癌细胞的侵袭能力会有所下降；在肝癌中，外泌体来源的lncRNA ROR可促进肝癌细胞在缺血环境下的存活且在对化疗的抵抗性中也发挥重要作用；在胃癌中，血浆中lnc00152主要存于外泌体中，相较传统的生物学标志物癌胚抗原和CAl99，血浆外泌体的lnc00152更具诊断优势。因此，这些肿瘤细胞来源外泌体中特异性lncRNA标志物就会成为肿瘤诊断检测的高特异性指标，能克服直接从血液中提取RNA进行检测过程中非检测物质的干扰，并且可以暗示出肿瘤发展情况和侵袭程度，通过检测体液尤其是外周血中的外泌体的情况使基于外泌体的诊断和随访更加容易。

外泌体常用的分离方法有超速离心法、磁珠免疫捕获法、沉淀法。超速离心法耗时耗力，需要大量初始样本；磁珠免疫捕获法特异性高，操作方便，但目前基于外泌体的标志物(CD63、CD9蛋白)的方法不能反映肿瘤的特异性；沉淀法时间短，可行性强，但外泌体特异性差，纯度低。